密码子优化提高海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的表达水平

目的优化灰色链霉菌海藻糖合成酶(Trehalose synthase,TreS)基因密码子,提高海藻糖合成酶大肠杆菌基因工程菌株表达水平。方法基于大肠杆菌基因组密码子偏好数据表对tres基因进行密码子优化得基因tres1。基因工程法构建分别含tres及tres1基因的表达载体pET-26b(+)-tres和pET-26b(+)-tres1,CaCl2法转入大肠杆菌BL21(DE3)获得表达海藻糖合成酶的大肠杆菌基因工程菌株,采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对摇瓶发酵粗酶液进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析及酶活性测定以确定表达水平。结果 1707 bp海藻糖合成酶tres基因共优化碱基序列268 bp,优化后序列的GC含量由65.8%降低至54.4%,密码子适应指数(CAI)由0.37提升至0.97,SDS-PAGE及酶活性分析表明,含pet-26b(+)-tres1表达载体的大肠杆菌基因工程菌株海藻糖合成酶蛋白表达量高,酶活性比含pet-26b(+)-tres工程菌提高60.3%以上。结论密码子优化可有效提高海藻糖合成酶TreS蛋白在大肠杆菌中的表达,为海藻糖合成酶的异源高效表达提供了重要参考。     

中性蛋白酶基因在大肠杆菌中诱导表达条件的研究

采用PCR方法从枯草芽孢杆菌中扩增得到中性蛋白酶基因npr,与表达载体pET-22b(+)连接构建成重组质粒pET22b-npr,转化大肠杆菌BL21得到重组工程菌株。经IPTG诱导,其所含有的中性蛋白酶基因可高效表达。研究不同的表达条件对中性蛋白酶表达水平的影响,发现当培养液的OD_(600)值达到0.6～0.8时,添加诱导剂IPTG至终浓度为0.8 mmol/L,28℃诱导7h,重组工程菌中性蛋白酶的表达量最高,SDS-PAGE电泳结果显示出明显的分子质量约43 ku的特异性蛋白条带。     

康氏木霉纤维素酶CBHI基因克隆及在大肠杆菌中的表达

将康氏木霉(Trichoderma koningii)总RNA反转录成cDNA第一链,并以之为模板进行RT-PCR,合成约1.5kb的纤维二糖水解酶Ⅰ(cbh I)基因.cbhI基因经测序确认后克降到表达载体pET-30a(+)上,PCR和双酶切鉴定筛选阳性重组子;将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,并用0.4mmol/L的IPTG诱导表达重组蛋白.实验结果:cbhI基因在BL21(DE3)plysS中胞内融合表达,重组蛋白pNPC酶活为15.6U/L,最适反应温度为45℃,最适pH值为5.0,Mn2+对酶活力有明显的促进作用,SDS-PAGE表明重组蛋白分子量约为70kDa.     

外切型琼胶酶AgaO的高效表达及酶学性质表征

根据大肠杆菌的密码子偏好性,优化外切型琼胶酶AgaO的基因并人工全合成,克隆入表达载体质粒pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),优化表达条件即诱导温度、诱导时间和诱导剂IPTG终浓度,纯化重组蛋白rEAgaO,并分析其酶学性质变化。结果表明,重组酶rEAgaO在16 ℃、IPTG终浓度0.1 mmol/L条件下诱导20 h时表达量最高;95%以上的重组蛋白质为水溶性表达,产量约为1432.7 mg/L,较优化前原始基因的产量提高了10.9倍;重组酶rEAgaO的最适反应温度为45 ℃,在低于40 ℃的温度下预处理2 h后,仍然具有90%以上的残余活性,最适pH为7.0,在pH6.0~10.0不同缓冲体系4 ℃处理2 h仍保留69.5%以上的活性;该酶降解琼脂糖后的最终产物经TLC分析鉴定为新琼二糖。基因密码子优化虽不改变蛋白质氨基酸序列,但可明显提高水溶性重组蛋白质的产率及酶活,对促进相关酶类的生产和应用具有借鉴意义。     

植物甜蛋白monellin基因工程菌表达条件的研究

将带有monellin基因的重组分泌型表达载体pETMO转入大肠杆菌BL21(DE3),得到重组工程菌株BMC33。经IPTG诱导,其所含有的甜蛋白基因可高效表达。研究不同的表达条件对甜蛋白表达水平的影响,得到优化发酵条件:装液量为50 mL/250 mL三角瓶,当培养液OD值达0.8时,添加诱导剂IPTG至终浓为0.9mmol/L,32℃诱导5 h。此时,甜蛋白monellin表达量可高达细菌可溶性蛋白的44.8%。     

噬菌体基因Ⅴ蛋白基因的合成、重组表达及功能分析

目的:研究丝状噬菌体基因V蛋白(gene V protein,GVP)基因的合成、重组表达及其功能。方法:根据GVP的基因序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计合成了8个寡核苷酸片段,利用重叠延伸PCR合成GVP基因序列,将其与原核表达载体pET-28a-c(+)质粒重组,转化大肠杆菌,获得GVP蛋白阳性表达菌株,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,产物经Ni+-NTA琼脂糖凝胶层析纯化,获得目的蛋白GVP,DNA结合实验检测其功能。结果:成功合成出GVP基因,重组体在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导获得高效表达,DNA结合实验表明GVP与单链DNA间解离平衡常数Kd=7.27×10-5mol/L。结论:重组构建并高效表达的GVP蛋白具有较高单链DNA结合能力,可用于食品病原微生物特定单链DNA分子的浓缩和分离。     

密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶基因xylA的克隆及其表达条件的优化

为克隆、表达密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶(GI)基因xylA,并对其诱导表达条件进行初步优化。采用Slowdown PCR方法克隆得到密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)CICIM B0118(A)的葡萄糖异构酶基因xylA,构建pET-28a(+)-xylA 表达载体,并转化至E. coli BL21 (DE3),经异丙基-β -D- 硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并对其表达产物进行SDS-PAGE 电泳。结果表明,融合蛋白分子质量约为45kD。在诱导时间9h、0.6mmol/L IPTG、30℃和OD600nm 值为0.8 的最适培养条件下,酶比活力最高达到62.42U/mL。     

人工合成的单链甜蛋白monellin基因在大肠杆菌中的高效表达

根据已报道的单链monellin甜蛋白的氨基酸序列,采用细菌偏爱密码子,人工合成了全长294bp的monellin基因。插入到大肠杆菌表达载体pET22b中,构建重组分泌型表达载体pETMO。经IPTG诱导pETMO所含有的甜蛋白基因可在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,表达量占菌体可溶性蛋白的44.8%。且经纯化后测定其甜度是蔗糖的3000倍。     

太平洋牡蛎中类FUT10蛋白的原核表达及免疫印迹鉴定

目的 原核表达牡蛎类FUT10(Fucosyl-transferase 10)蛋白并探究与人FUT10的免疫相似性。方法 本研究基于课题组前期克隆完整的类FUT10基因cDNA, 依照大肠杆菌表达蛋白的密码子偏爱性, 利用DNAMAN软件对类FUT10基因开放阅读框序列进行优化并合成, 亚克隆至载体pET-28a(+), 得到重构质粒pET-OFu3, 转入大肠杆菌BL21(DE3), 通过异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后获取目的蛋白, 进行蛋白质印迹法(Western blot)鉴定。结果 在37 ℃、IPTG终浓度为1.0 mmol/L诱导4 h后, 出现蛋白分子量大小约为55 kDa的条带。该蛋白条带与抗6×His(组氨酸)标签抗体、抗人FUT10抗体均能发生特异性结合。结论 优化后的类FUT10蛋白与人体转移酶FUT10具有相似的免疫原性, 类FUT10蛋白的可溶性表达为探究太平洋牡蛎体内Ⅱ型血型抗原合成路径提供研究基础, 进一步探索了牡蛎体内特异性结合诺如病毒的分子机理。     

大肠杆菌中芥蓝抗坏血酸过氧化物酶基因的高效表达

将芥蓝抗坏血酸过氧化物酶(Apx)在大肠杆菌中高效表达。以芸薹属植物apx保守区基因序列为基础,利用PCR,RACE技术从芥蓝中扩增得到全长为753 bp的芥蓝apx编码基因,用DNAMAN V6软件分析该基因氨基酸组成,计算出蛋白分子质量约为27.6 kDa。通过构建重组质粒pET-28a-apx,转化大肠杆菌E.coli BL21,实现了芥蓝Apx的可溶性表达。通过单因素实验优化诱导表达条件,结果表明:0.2 mmol/L IPTG,23℃诱导培养10 h为最佳诱导条件。采用Ni2+亲和层析,纯化了重组蛋白,并得到重组酶最适反应条件为pH 6.5和40℃。为进一步研究Apx的生理特性和功能打下基础。     

栖热袍菌α-葡糖苷酶的基因克隆表达及酶学性质

用分子克隆手段获得栖热袍菌(Thermotoga neapolitana DSM 4359)中的α-葡糖苷酶基因,构建该基因的原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。以Thermotoga neapolitana DSM 4359的α-葡糖苷酶基因DNA为模板,通过PCR扩增目的基因,并连接至表达载体中,构建重组质粒pET-28a-glu,然后转化到大肠杆菌中,加IPTG诱导获得重组蛋白。提取粗酶,用葡萄糖测定试剂盒测酶活。序列分析结果表明,该基因的读码框碱基长度为2166bp,编码722个氨基酸;SDS-PAGE电泳结果表明,α-葡糖苷酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,蛋白分子量约为62KDa;酶的最适反应温度为70℃,最适pH为5.0。     

褐藻胶裂解酶基因在大肠杆菌中的表达及其酶学性质

作者从蜡样芽孢杆菌F1-5-10中提取DNA,通过PCR克隆得到褐藻胶裂解酶基因后,将其构建到pET-30a(+)上并在大肠杆菌BL21菌株中进行高效诱导表达,继而对纯化得到的褐藻胶裂解酶蛋白进行活性检测和酶学特性研究。实验结果表明:PCR扩增出1035bp大小的褐藻胶裂解酶基因algl(GenBank登录号:GU585575),SDS-PAGE电泳结果显示出相对分子质量约为45 000的特异性蛋白质条带。表达条件优化实验结果表明0.4mmol/L浓度的IPTG 32℃诱导4h重组蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白质质量的36%。测定褐藻胶裂解酶酶活性,酶活力为11.7U/mg。酶学性质研究表明:ALGL的酶活最适温度为35℃,热稳定性较差,最适pH值为6.6,Ca2+、Mg2对酶活有激活作用,ALGL催化褐藻胶的Km值为1.89mg/mL,Vmax为15.01U/mL。     

抗菌肽cecropin P1在大肠杆菌中的融合表达及活性测定

目的 在大肠杆菌中融合表达抗菌肽cecropin P1.方法 根据抗菌肽ceeropin P1的氨基酸序列,依照大肠杆菌密码子的偏爱性,采SOE技术合成cecropin P1的编码基因;将其克隆至表达载体pET-32a(+)上,经IPTG诱导表达,超声上清液用Ni·NTA亲和层析初步纯化,经肠激酶切割后,用薄层平皿琼脂...     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达与优化

从宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001中克隆木聚糖酶基因xynⅡ,将不含原酶信号肽编码序列的xynⅡ以正确的读码框克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中,构建成重组质粒pET-Xn并转化大肠杆菌,得到重组工程菌KN21。通过对其进行IPTG浓度、温度等诱导培养条件的优化后,胞内重组木聚糖酶活力最高达到81.77U/mg。对重组木聚糖酶进行酶学性质研究,显示其最适温度为45℃,最适pH为4.5。     

花生过敏原Ara h2.02原核表达方法条件的研究

将重组质粒pET-32a(+)-Arah2.02转化表达宿主菌Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS—PAGE电泳分析,结果显示表达的蛋白大小约为38kDa。进一步用通用His标签抗体进行Western Blotting检测,结果表明成功克隆表达了花生过敏原Arah2.02。为获得较多的重组蛋白Arah2.02,分别对IPTG浓度、摇床转速、诱导温度和时间等条件进行选择,确定最佳条件为:IPTG浓度0.3mmol/L,摇床转速220r/min,诱导温度37℃,诱导时间2h。     

分散泛菌胞内脱乙酰酶在大肠杆菌中重组表达条件优化及酶学特性

目的 对分散泛菌的胞内脱乙酰酶(Pantoea dispersa N-acetylglucosamine deacetylase, Pd-nagA)进行表达条件优化及酶学性质分析。方法 本研究使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术对分散泛菌全基因组中Pd-nagA基因序列进行全长扩增，将含有Pd-nagA基因的质粒pET-28a(+)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，同时采用单因素实验，优化诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及乳糖类似物异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)的浓度，采用Ni2+-次氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid，NTA)进行重组酶的纯化，再对其酶学特性进行测定。结果 以pET-28a(+)质粒作为表达载体，大肠杆菌BL21(DE3)成功表达了可溶形式的Pd-nagA蛋白，分子量约为40 kDa。当诱导温度为28℃，诱导前菌液OD600值为1.2，IPTG浓度为0.6 mmol/L，诱导时间为20 h时，Pd-nagA蛋白得到了大量表达。通过薄层层析法分析表明Pd-nagA重组蛋白能够在体外转化N-乙酰氨基葡萄糖生成氨基葡萄糖，Pd-nagA重组蛋白能够在高盐溶液中保持一半的相对酶活性，该酶储存10 d的相对活性仍然保持在90%以上，具有良好的储存稳定性，催化N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine, GlcNAc)生成氨基葡萄糖(glucosamine, GlcN)反应条件简单快捷。结论 本研究成功异源表达了具有催化活性的Pd-nagA酶，并对表达条件进行优化及酶学特性探究，可为工业上单酶催化制备氨基葡萄糖提供一定的理论参考。     

植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因在大肠杆菌中表达

构建乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒并表达。以植物乳杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增亚硝酸盐还原酶基因,连接到表达载体pET-32a(+)上,构建的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,菌体总蛋白经SDS-PAGE鉴定显示重组质粒诱导表达产物有特异性蛋白条带。该表达产物经细菌亚硝酸盐还原酶试剂盒测定显示有明显的酶活性。实验结果为深入研究植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶提供有益的参考。     

Thermotoga neapolitana α-葡萄糖苷酶基因克隆及表达

本文拟克隆新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana DSM 4359)的一种α-葡萄糖苷酶基因(TNAG),其GenBank注册号为lcl27401。首先以T.neapolitana DSM 4359基因组DNA为模板,通过PCR扩增目的基因并完成T克隆,在NCBI数据库中比对结果表明:目的基因与Thermotoqa sp.RQ2等氨基酸序列相似度高于99%。再将目的基因连接至表达载体pET-32a(+),并导入大肠杆菌Rosetta中用IPTG诱导表达。SDS-PAGE显示表达蛋白的大小约为72KDa。热纯化后酶液测活反应的最适温度为80℃,最适pH在5.0左右。     

碱性芽孢杆菌木聚糖酶基因的克隆及表达

本实验从广西红树林土壤中筛选出一株产木聚糖酶的耐碱菌HSL38,经过16S rDNA鉴定,其与碱性芽孢杆菌Bacillus halodurans C-125(GenBank：NC_002570.2)的同源性达到99%。参考Bacillus halodurans C-125的β-1,4-木聚糖酶基因xynA设计引物,扩增出HSL38中的β-1,4-木聚糖酶基因xyl-BH-G10,其与xynA的同源性达到99%,编码396个氨基酸残基(45.27kD),属于糖基水解酶GH10家族。将xyl-BH-G10基因与表达载体pET-30a-c(+)连接,构建重组载体,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白。结果表明,在最佳诱导条件下,木聚糖酶基因xyl-BH-G10在大肠杆菌细胞内高效表达,酶活力达到55.28U/mL,是原菌株HSL38发酵液酶活力的4倍。     

短芽孢杆菌耐碱性木聚糖酶（xylB）的分子生物学研究

根据已发表的环状芽孢杆菌(Bacillus circulan)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)木聚糖酶基因序列设计引物,首次扩增出短芽孢杆菌(Bacillus brevis)中的β-1,4-内切木聚糖酶(以下简称木聚糖酶,E.C.3.2.1.8)基因片段.序列分析表明,该基因与已登录的木聚糖酶基因AF490979.1和AF490980.1分别有97%和96%的同源性,与其它芽孢杆菌属的同源性也较高.将此基因片段插入表达载体pET-30a(+)构建重组质粒,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3).重组基因工程菌破碎后进行SDS-PAGE电泳检测,结果表明,IPTG诱导后,木聚糖酶基因在大肠杆菌的胞内获得高效表达,且酶活力最高可达26.14 U/mL.重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH为9.0.