重组酶聚合酶扩增、重组酶介导等温扩增及酶促重组等温扩增技术在食源性致病菌快速检测中的研究进展

随着人民生活水平的提高,食品安全问题也越来越受到社会关注,其中生物（微生物）因子是影响食品安全的最主要因素。食品安全研究领域针对生物（微生物）因子的检测技术众多,其中等温扩增技术因不需依赖复杂的仪器设备,能够快速、准确地进行生物成分检测而被广泛应用,尤其是新发展起来的重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification,RPA）、重组酶介导等温扩增（recombinase-aided amplification,RAA）和酶促重组等温扩增（enzymatic recombinase amplification,ERA）技术。这3 种等温扩增技术相对于其他等温扩增技术具有反应条件更温和、引物设计更简单等优点,且检测原理相似,本文对这3 种技术进行对比研究,从原理、概念以及近年来在食源性致病菌快速检测方面的研究应用情况进行综述,概括其在食品检测中的优势和面临的实际问题,并对未来的发展前景进行展望。     

环介导恒温核酸扩增法在病原微生物快速检测领域的应用

环介导恒温核酸扩增法(loop-mediated isothermal amplification of DNA,简称LAMP)是一种新型的核酸扩增方法,可以针对靶基因的目标区域形成多种片段的扩增产物。目前对于LAMP产物的检测主要有沉淀法,荧光法和电泳法。与PCR相比,LAMP不需要模板的热变性、长时间的温度循环、繁琐的电泳等,其扩增与检测过程可以实现一步完成。因此LAMP技术具有快速、简单、高特异性、高灵敏度和成本低廉的优点。随着LAMP技术的不断完善,在可预见的将来,其将在核酸扩增领域逐渐取代PCR反应,推动检测技术向更快捷简便、更精确廉价的方向发展。目前LAMP技术已应用于致病微生物和胚胎性别鉴定等检测,其中致病微生物包括致病细菌、真菌、病毒及寄生虫等。该检测技术在食品安全、临床医疗及水产等主要领域也受到广泛应用。本文主要介绍LAMP反应的特点及其在细菌、病毒、寄生虫和水产动物病原微生物快速检测领域中的应用。     

环介导恒温核酸扩增法的研究和技术方法

核酸扩增是生命科学领域最具价值的工具之一,在临床微生物检测、传染性疾病以及基因诊断方面具有独特的应用价值。传统的检测方法均存在一定的局限性,因此基于核酸扩增的检测方法具有广阔的应用前景。环介导恒温核酸扩增法（loop-mediatedisothermalamplificationofDNA,简称LAMP）是一种新型的核酸扩增方法,由于其特异性和灵敏度高、简便快捷且成本低廉,因此在可预见的将来,LAMP技术将在核酸扩增领域逐渐取代PCR反应,推动检测技术向更快捷简便,更精确廉价的方向发展。     

Development of an isothermal amplification-based assay for the rapid detection of Cronobacter spp.

Cronobacter spp. is an opportunistic pathogen that is associated with rare but life-threatening neonatal infections resulting from the consumption of contaminated powdered infant formula milk (PIF). In the present study, we developed recombinase polymerase amplification (RPA) and real-time RPA for the detection of Cronobacter spp. in PIF for the first time by targeting the ompA gene. The specificity and sensitivity of the RPA and real-time RPA were validated and the practical applicability of these methods for the detection of Cronobacter spp. in artificially contaminated PIF samples was proved by comparing their reaction time, sensitivity, and efficacy with those of real-time PCR and the Chinese traditional method. The RPA and real-time RPA assays reduced the analysis time to less than 15 min and the results were as reliable as those of real-time PCR. Taken together, the RPA and real-time RPA assays served as fast, reliable, and sensitive techniques for the detection of Cronobacter spp.     

铜绿假单胞菌实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增方法建立及应用

目的建立一种快速检测铜绿假单胞菌的实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增(real-time RAA)方法。方法基于铜绿假单胞菌ecfX基因设计特异性引物和exo探针,通过灵敏性、特异性和疑似菌株检测评估所建立方法的有效性。结果 Real-time RAA方法在39℃等温条件下反应20 min即可实现对铜绿假单胞菌的有效检测;特异性强,仅对铜绿假单胞菌出现特异性扩增;灵敏性高,对铜绿假单胞菌基因组DNA的检出限为3.0×10~3 fg/反应,对纯培养铜绿假单胞菌的检出限为1.0×10~3 CFU/反应。应用所建立的real-time RAA方法对分离的36株疑似铜绿假单胞菌进行检测,结果均为铜绿假单胞菌,同VITEK 2 Compact生化鉴定方法和real-time PCR方法结果一致。结论本试验所建立的real-time RAA方法反应快速、操作简单、可靠性高,可用于不同来源的铜绿假单胞菌的快速检测和鉴定。     

实时荧光重组酶聚合酶扩增检测大肠埃希氏菌O157

目的建立实时荧光重组酶聚合酶扩增(real-time recombinase polymerase amplification,real-time RPA)检测大肠埃希氏菌O157的分析方法。方法根据大肠埃希氏菌O157的rfbE基因(S83460.1),设计特异性引物和exo探针,分别进行引物探针筛选和特异性、灵敏度以及稳定性探究,并对人工污染样品和实际样品进行检测,验证本研究方法的实用性。结果本方法在37℃恒温20 min内可完成对大肠埃希氏菌O157的定性检测,目的 DNA的检测限为0.01ng/μL,目的菌的检测限为10~3CFU/mL。在稳定性实验中,选择从100～0.001 ng/μL的10倍梯度稀释的目的 DNA进行每个浓度8个平行的测试, 0.01 ng/μL及以上浓度的DNA的8个平行均可稳定检出。对于大肠埃希氏菌O157的初始污染量为4 CFU/25 g的牛奶和鸡肉人工污染样品,增菌9 h后,可检出其中的目的菌。用本方法和国标方法 GB 4789.36-2016同时检测20份实际样品,结果一致。结论该方法快速、简便,可作为一种常温下大肠埃希氏菌O157的快速检测手段,应用于基层实验室或现场检测。     

环介导等温扩增检测技术的应用与方法改进

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近些年发展起来的一种新型核酸扩增技术,其原理是利用在线软件设计4条特异性引物,在具有强链置换活性的DNA聚合酶作用下,使模板两端引物的结合处循环出现环状单链结构,以实现恒温条件下的连续快速扩增,该方法具有特异性强、灵敏度高、耗时短且无需昂贵的热循环设备等优点。目前该技术在国内外已经广泛应用于细菌、病毒及寄生虫等病原体的检测以及鉴定胚胎性别。本文从LAMP技术的原理、方法改造、检测应用以及与其他检测方法的比较这4方面进行综述,为今后LAMP技术的应用提供理论依据并对未来的发展进行了展望。     

豉味玉冰烧酒勾兑准确放样系统

主要介绍豉味玉冰烧酒在勾兑过程由定型小样酒(200ml)到大样酒(20000kg)的准确放样系统     

Adaptor polymerase chain reaction for single molecule amplification

The adaptor polymerase chain reaction (PCR) permits the amplification of DNA fragments with arbitrary sequences. In this paper, we describe the successful amplification of plasmid-derived single molecule DNAs digested by a restriction enzyme. By using adaptors made of short and long oligonucleotides, nonspecific interactions during PCR were suppressed. The method will be applicable to the detection of single molecule DNA fragments even if their sequence is unknown.     

链置换恒温扩增快速检测单核细胞增生李斯特氏菌

目的开发单核细胞增生李斯特氏菌快速、简便、准确的链置换恒温扩增(strand displacement amplification,SDA)检测方法。方法根据单核增生李斯特菌特异性基因prfA基因片段,设计链置换扩增特异性引物,建立单核细胞增生李斯特菌SDA快速检测方法,同时对设计的引物的特异性和灵敏度进行研究。结果所建立的单核细胞增生李斯特菌SDA扩增方法灵敏度达到了7.0×10~2 CFU/mL,检验技术可以特异性地扩增单核增生李斯特菌。结论本试验所建立的单核细胞增生李斯特菌SDA检验技术具有快速、简便、特异性强的特点,具有在进出口实验室推广应用前景。     

等温扩增技术在食品中沙门氏菌检测中的应用

目的针对沙门氏菌肠侵袭蛋白基因设计适合交叉引物等温扩增法及环介导等温扩增法的特异性引物及探针,并进行应用评估。方法用19株沙门氏菌,35株近源菌进行特异性试验;通过定量DNA、纯菌液计数检测进行检测低限验证,与环介导等温扩增法进行比较;对6类18种食品根据ISO 5725-2:1994标准要求,以现行国家标准为基准方法对2种等温扩增法进行灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率及相对准确度等5方面验证。结果交叉引物等温扩增法与环介导等温扩增法具有相同的特异性,检测灵敏度较高于环介导等温扩增法,与基准方法比较的各项性能指标符合ISO的要求。结论该方法不需要复杂仪器,可作为食品中沙门氏菌快速定性检测方法使用,对口岸快速筛查、基层或偏远经济不发达地区顺利开展检测具有实际意义。     

重组酶聚合酶扩增技术及其在食品检测中的应用

近年来,食品安全问题日益突出,适用于现场的快速检测技术研发受到了研究者们的广泛重视。重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术作为一项新兴的核酸等温扩增技术,与传统的检测方法相比,具有灵敏度高、成本低、速度快等优点,且不需复杂仪器设备,可以在条件简陋的实验室和资源不足的户外等地实现检测和应用。本文介绍了RPA技术的概念和原理,综述了近年来RPA技术在食品检测中的应用,如食源性致病微生物的快速检测、转基因农产品识别和常见食品的物种鉴别等,概括了其在食品安全和食品产业领域中的优势和面临的挑战,并对RPA技术的未来发展前景提出了展望。     

等温扩增技术在食源性致病菌检测中的应用进展

等温扩增技术是近年来迅速发展的一类核酸扩增技术。相比于PCR,该技术具有高特异性、高敏感性、简单、便捷及低成本的特点。目前,核酸等温扩增技术在感染性疾病的诊断、基因多态性分析、疫情防治等方面已经有广泛应用,也有文献报道了其在细菌、病毒等病原体检测方面的应用。食源性致病菌和环境中的病原体检测等领域中,等温扩增技术展现了广阔的应用潜力,有望发展成为食源性致病菌检测的重要方法。本文综合国内外文献报道,对环介导等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、切刻内切酶核酸恒温扩增、交叉引物等温扩增、链置换等温扩增、SmartAmp技术等一系列等温扩增技术的原理、特性及其在食源性致病菌检测中的应用情况做一综述,从而为该技术在食源性致病菌检测的实际应用中提供参考和依据。     

PCR方法在区分牛奶牧场来源中的应用

以光明集团提供的采自8个牧场的牛奶为材料,提取DNA,利用PCR技术区分不同来源的牛奶是否有差异。PCR结果表明同一牧场不同天数的扩增条带基本一致;同一牧场不同引物的PCR扩增结果存在差异;同一引物不同牧场的PCR扩增结果有差异,主要表现在泳带数不同,强弱带的分子量也不一样,据此可以区分不同来源的牛奶。     

PT95菌株和6株标准青霉菌株的亲缘关系分析

目的分析PT95菌株和6株标准菌株的亲缘关系。方法用RAPD技术分析PT95菌株、4株PT95的突变株和6株标准菌株，并应用SPSS软件构建聚类图。结果PT95菌株均与汤姆青霉系的3种已知标准菌有一定的差异，根据聚类图可清楚地将PT95菌株与其它菌株分开。结论PT95菌株不同于任一汤姆青霉系的已知菌，可能是一新种。     

解旋恒温基因扩增技术在螨虫鉴定中的应用前景

螨虫种类多,分布广,危害多样,已成为人们关注的对象。随着进出口植物、植物产品和食品的增加,其携带螨虫的风险越来越高,许多国家把螨虫作为检疫对象设置技术壁垒。由于螨虫体型微小,形态鉴定比较困难,一直是口岸检疫的一大难点。随着现代分子技术的发展,迫切需要建立快速、灵敏、准确的螨类检测方法。解旋酶恒温基因扩增技术(HDA)是一种简便、快速、高效、灵敏度高的体外恒温基因扩增技术。该技术依靠DNA解旋酶解开双链DNA、单链DNA结合蛋白(SSB)维持单链状态、DNA聚合酶催化靶片段的扩增。HDA不需要昂贵的仪器设备,适用于基层实验室。HAD能扩增微生物基因组DNA、病原菌DNA、质粒DNA和c DNA等,从其灵敏性、准确性和可操作性几方面来看,该方法适用于螨虫鉴定。     

单增李斯特氏菌快速检测方法的建立

建立单增李斯特氏菌的快速检测方法.针对单增李斯特氏菌virR基因序列设计特异性引物及探针,建立等温扩增法,并利用免疫金标试纸条对结果进行检测.用10株单增李斯特氏菌、6株李斯特菌属菌株及其他食源性致病菌24株进行特异性试验;通过定量DNA、纯菌液计数进行灵敏度验证.结果表明建立方法具有较好的特异性;增菌液检测灵敏度为102 cfu/test,DNA检测灵敏度为10°pg/test.建立的单增李斯特氏菌的快速检测方法特异性较好、灵敏度高,适合于单增李斯特氏菌快速筛选检测.     

重组酶介导等温扩增法检测食品中铜绿假单胞菌

目的 建立重组酶介导等温扩增（Recombinase-aided amplification,RAA）法,快速、灵敏、特异检测食品中铜绿假单胞菌的分析方法。方法 针对铜绿假单胞菌lasB基因的特异性保守区域,设计RAA特异性引物和exo探针,筛选出最优组合;对提取的目标基因组DNA进行检测,确定方法的特异性和灵敏度,并通过人工污染实验,比对不同检测方法对食品样品的检出限。结果 建立的铜绿假单胞菌lasB基因RAA检测方法特异性良好,仅对铜绿假单胞菌有扩增曲线,对其他致病菌无交叉反应;方法对纯菌液的灵敏度为1.7 pg/μL。人工污染实验表明,方法对肉类样品中铜绿假单胞菌的检出限与传统方法一致,达1.0×103 CFU/mL;RAA方法检测时间仅需20min。结论 本研究建立的铜绿假单胞菌实时荧光RAA检测方法特异性强、灵敏度高、反应时间短,可用于食品中铜绿假单胞菌的快速检测。     

沙门氏菌的依赖于核酸序列恒温扩增检测方法的建立

采用自行建立和优化的依赖于核酸序列恒温扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)检测体系,对沙门氏菌进行检测。采用沙门氏菌的invA基因为目的片段设计特异性引物,建成可快速检测沙门氏菌的NAS-BA检测法,并进行了特异性和灵敏度试验。结果表明:所建立起的NASBA检测方法,灵敏度为7.1×102cfu/ml,高于普通PCR方法。     

Loop-mediated isothermal amplification-based microfluidic chip for pathogen detection

Abstract

Due to the significant growth of food production, the potential likelihood of food contamination is increasing. Foodborne illness caused by bacterial pathogens has considerably increased over the past decades, while at the same time, the species of harmful microorganisms also varied. Conventional bacterial culturing methods have been unable to satisfy the growing requirement for food safety inspections and food quality assurance. Therefore, rapid and simple detection methods are urgently needed. The loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology is a highly promising approach for the rapid and sensitive detection of pathogens, which allows nucleic acid amplification under isothermal conditions. The integration of the LAMP assay onto a microfluidic chip is highly compatible with point-of-care or resource-limited settings, as it offers the capability to perform experiments in combination with high screening efficiency. Here, we provide an overview of recent advances in LAMP-based microfluidic chip technology for detecting pathogens, based on real-time or endpoint determination mechanisms. We also discuss the promoting aspects of using the LAMP technique in a microfluidic platform, to supply a guideline for further molecular diagnosis and genetic analysis.