Taqman探针荧光PCR法检测食品中的大肠埃希氏菌O145

针对大肠埃希氏菌O145的O抗原基因簇的wck D基因的特异性序列设计引物和Taqman探针,建立检测大肠埃希氏菌O145的荧光PCR方法,对其灵敏度、特异性进行验证,并将其用于食品样品的检测。结果表明,本研究中的方法可实现对大肠埃希氏菌O145的特异性扩增,其它27株非O145大肠埃希氏菌和20株非大肠埃希氏菌细菌的菌株均无扩增;检测的灵敏度可达165拷贝/反应;339份食品样品EC肉汤增菌后用本荧光PCR法进行检测,检出大肠埃希氏菌O145阳性31份,阳性率为9.1%。实验结果表明,本研究成功建立了可用于食品中大肠埃希氏菌O145的Taqman探针荧光PCR方法,食品样品采用EC肉汤增菌24 h、热裂解法提取核酸,增菌后检测所需时间由至少3 d~7 d缩短为仅需2 h~3 h,食品检测全过程仅需约28 h,经证实本方法特异性强、操作简便,为食品中大肠埃希氏菌O145提供了一种的快速检测手段。     

重组酶介导等温扩增法检测食品中铜绿假单胞菌

目的 建立重组酶介导等温扩增（Recombinase-aided amplification,RAA）法,快速、灵敏、特异检测食品中铜绿假单胞菌的分析方法。方法 针对铜绿假单胞菌lasB基因的特异性保守区域,设计RAA特异性引物和exo探针,筛选出最优组合;对提取的目标基因组DNA进行检测,确定方法的特异性和灵敏度,并通过人工污染实验,比对不同检测方法对食品样品的检出限。结果 建立的铜绿假单胞菌lasB基因RAA检测方法特异性良好,仅对铜绿假单胞菌有扩增曲线,对其他致病菌无交叉反应;方法对纯菌液的灵敏度为1.7 pg/μL。人工污染实验表明,方法对肉类样品中铜绿假单胞菌的检出限与传统方法一致,达1.0×103 CFU/mL;RAA方法检测时间仅需20min。结论 本研究建立的铜绿假单胞菌实时荧光RAA检测方法特异性强、灵敏度高、反应时间短,可用于食品中铜绿假单胞菌的快速检测。     

超高效液相色谱-串联质谱法检测中草药中赭曲霉毒素A

本研究通过优化液相色谱条件和质谱条件,并结合碳酸氢钠溶液提取稀释的方法法有效克服了基质效应的干扰,建立了中草药中赭曲霉毒素A的超高效液相色谱-串联质谱法快速检方法。试样经碳酸氢钠溶液提取,超声波提取,再经过免疫亲和柱净化后,用C18液相色谱柱分离,多级反应选择离子正离子模式检测。经方法学验证,赭曲霉毒素A质量浓度在0.1~50.0μg/L范围内呈现良好的线性关系,r0.99;样品在1.0、2.0和10.0μg/kg三个添加水平下的回收率为78.5%~98.0%;相对标准偏差为2.6%~11.8%;方法检出限为1.0μg/kg。将该方法应用于实际8批样品的检测,结果显示8批样品中检出1批的赭曲霉毒素A检测结果呈阳性(7.3μg/kg)。实际样品检测结果表明,本方法可实现中草药中赭曲霉毒素A灵敏、准确的定性定量分析。     

冰鲜鸽肉贮藏过程中的微生物菌群多样性

采用Ion Torrent PGM高通量测序技术,从分子水平上对冰鲜鸽肉贮藏过程中的细菌在4 ℃与37 ℃ 2 种增菌温度下的细菌群落结构、丰度及演替规律进行深入研究。结果表明：在整个贮藏过程中,4 ℃与37 ℃增菌处理的结果表明：在门水平上,冰鲜鸽肉中的微生物菌群均以变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门为优势菌门,其中变形菌门占比达78%;在科水平上,4 ℃增菌条件下,假单胞菌科、莫拉氏菌科、假诺卡氏科及肠杆菌科为优势菌科,37℃增菌条件下,气单胞菌科、动球菌科、肠杆菌科及假单胞菌科为优势菌科,占比最多的为假单胞菌科。2 种增菌温度下细菌群落的多样性及菌群结构变化反映了冰鲜鸽肉潜在的安全风险,可用于冰鲜鸽肉冷藏过程或贮藏过程中温度失控情况下的质量管理。     

LAMP实时浊度法快速检测食品中产志贺毒素大肠埃希氏菌

针对产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)stx1和stx2基因的特异性序列分别设计4条特异性引物,采用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,利用实时浊度仪建立食品中STEC的LAMP实时浊度法快速检测方法。LAMP反应在实时浊度仪63℃恒温下1 h可完成。对方法的特异性、灵敏度、稳定性进行了评价,并在实际样品检测中进行应用。经优化该方法的检测灵敏度可达150拷贝/反应,4株STEC菌株LAMP扩增结果与其基因型一致,其他21株非STEC菌株均未出现非特异性扩增。395份食品样品检出STEC阳性68份(阳性率为17.2%),所检食品类别中畜产品阳性率最高(达31.3%),禽产品、水产品和可生食蔬菜均有少量阳性样品检出,阳性样品中以stx2基因阳性型为主。结果表明,LAMP实时浊度法具有快速、灵敏、特异性强、操作简便的优势,适用于食品中STEC的快速筛查。     

食品中大肠埃希氏菌O121荧光PCR检测方法的研究

针对大肠埃希氏菌(Escherichia coli,E.coli)O121的O抗原基因簇的vio A基因的特异性序列设计引物和探针,通过对荧光聚合酶链式反应(real-time PCR)扩增条件的优化,建立检测E.coli O121的血清型特异性荧光PCR方法。E.coli O121标准菌株呈现扩增曲线,其它22株非O121 E.coli和19株非E.coli细菌的菌株均无扩增,检测的灵敏度可达155拷贝/反应。339份食品样品用EC肉汤增菌后用本荧光PCR法进行检测,检出E.coli O121阳性9份,阳性率为2.7%,其中市场上采购获得的生猪肉和生牛肉阳性率达4.1%。上述试验结果表明,本方法特异性强、操作简便,食品中E.coli O121检测全过程可在1.5 d内完成,适用于食品中E.coli O121的快速检测。     

真空包装低温熟制鸽子货架期预测模型的建立

为了研究低温熟鸽货架期模型,对真空包装低温熟制鸽子在不同温度条件下贮藏的品质变化进行了评价：贮藏在4℃,10℃,15℃,20℃,25℃样品的菌数总数、总挥发性盐基氮均随着贮藏天数增加有不同程度的增加,在10～25℃条件下,贮藏后期菌落总数变化趋势高于贮藏初期;与 4 ℃和10℃的样品相比,其它3组温度下的感官变化更加明显。此外,所有样品的总大肠菌群平板计数均小于10 CFU/g,且不同贮藏温度下没有差异。利用熟制鸽子菌落总数指标,通过Gompertz方程和平方根方程进行拟合,建立低温熟鸽货架期模型。该模型的预测的数值与实践测定值的相对误差在±10%以下。表明该模型是可靠的。     

基于双重微滴式数字PCR对转基因油菜RF1品系的定量方法

基于微滴式数字PCR平台,建立了一种在同一个微滴反应体系中同时检测油菜样品中两种靶标序列的双重微滴式数字PCR(duplex-ddPCR)定量分析方法。试验结果表明,内参基因和品系特异性基因均能特异性扩增出来,所建立的RF1品系duplex-ddPCR方法特异性好。在单位体系内参和外源基因拷贝数位于18~23077的区间内可以呈现出良好的线性,r2=0.999。经验证,本方法的定量检测限(LOQ)和最低检测限(LOD)分别为18拷贝/反应和3.7拷贝/反应。精密度试验结果表明两组浓度的DNA样品所得到的平行试验结果的标准偏差(relative standard deviations,RSD)介于8.40%~24.50%,准确度试验结果显示标准偏差RSD值介于5.97%~12.64%,均达到了对方法精密度RSD和准确度RSD小于25%的要求。综上所述,本研究所建立的duplex-ddPCR定量分析方法可用于转基因油菜RF1的定量检测。