环介导等温扩增检测技术的应用与方法改进

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近些年发展起来的一种新型核酸扩增技术,其原理是利用在线软件设计4条特异性引物,在具有强链置换活性的DNA聚合酶作用下,使模板两端引物的结合处循环出现环状单链结构,以实现恒温条件下的连续快速扩增,该方法具有特异性强、灵敏度高、耗时短且无需昂贵的热循环设备等优点。目前该技术在国内外已经广泛应用于细菌、病毒及寄生虫等病原体的检测以及鉴定胚胎性别。本文从LAMP技术的原理、方法改造、检测应用以及与其他检测方法的比较这4方面进行综述,为今后LAMP技术的应用提供理论依据并对未来的发展进行了展望。     

实时荧光LAMP技术快速检测变形杆菌

建立一种快速检测变形杆菌的方法。采用实时荧光LAMP(Real Amp)技术检测变形杆菌,分析Gen Bank中公布的变形杆菌atp D基因序列,针对其6个区域设计4条引物,利用实时荧光监测仪等温(62℃)扩增模板DNA,通过与电脑相连进行实时监测,对该方法检测变形杆菌的特异性、灵敏度、人工污染猪肉检出限等方面进行研究,并将该检测法的灵敏度与普通环介导等温扩增(LAMP)检测法进行比较。结果表明,Real Amp检测方法比普通LAMP检测方法更加方便快捷,20 min内即可判定结果;用于特异性试验的19株试验菌株中,6株变形杆菌呈阳性结果,其他13株非变形杆菌均呈阴性结果;检测纯菌的灵敏度为8.1CFU/m L,是普通LAMP检测方法的10倍;人工污染猪肉的检出限为81CFU/m L。本研究建立的Real Amp检测方法操作简单,耗时短,特异性强、灵敏度高,能够实现对变形杆菌的快速检测。     

实时荧光环介导等温扩增技术检测牛乳中的蜡样芽孢杆菌

建立牛乳中蜡样芽孢杆菌便捷可靠的检测方法,根据已公布的蜡样芽孢杆菌hblA基因序列设计内外引物,并向反应体系中加入荧光染料SYBRGreen Ⅰ,利用实时荧光监测仪,建立实时荧光环介导等温扩增技术（real-timefluorescence loop-mediated isothermal amplification,RealAmp）检测蜡样芽孢杆菌的方法,扩增产物经电泳和酶切鉴定。通过21 株致病菌验证RealAmp特异性,并比较了RealAmp与普通环介导等温扩增技术的敏感性,对人工污染的检出限进行了测定。结果表明对21 株致病菌进行特异性实验,4 株蜡样芽胞杆菌呈阳性结果,17 株非蜡样芽胞杆菌均呈阴性结果。RealAmp检测纯菌的灵敏度为8.2 CFU/mL,比普通环介导等温扩增技术的灵敏度高10 倍,人工污染牛乳RealAmp的检出限为8.2 CFU/mL。并且在20 min左右即可判定结果。该方法快速、准确、灵敏度高、操作便捷、可实时监控检测蜡样芽孢杆菌,有望成为快速检测蜡样芽孢杆菌的有效方法。