一株嗜热菌木糖异构酶的纯化与性质研究

研究了1株嗜热菌(Anoxybacillus flavithermus)所产木糖异构酶的分离纯化以及酶学性质。结果表明,经硫酸铵沉淀、Sephadex G-75凝胶过滤、纤维素DE-52弱阴离子交换柱和Q Sepharose Fast Flow强阴离子交换层析得到的木糖异构酶,分子量约为181 ku,由4个相同分子量的亚基组成。酶反应的最适温度为80℃,最适为pH为7.0且最适pH范围宽泛,pH6.0~11.0酶反应活性能保持80%左右。该酶热稳定性及耐碱性能良好,70℃保温1 h后酶活仍能保持近80%左右;pH5.0~8.0保温1 h后酶活仍能保持近80%以上,甚至pH12.0保温1 h后酶活性仍能保持40%左右。Mn2+和Co2+对酶活性有明显促进作用,Zn2+、Cu2+以及Al3+对酶活性有一定程度的抑制。     

青藏高原土壤低温产蛋白酶菌株的筛选及酶学性质研究

从青藏高原土壤样品分离保藏的菌种中筛选到低温条件下产蛋白酶菌株LS20-2,对其进行生理生化试验以及分子生物学鉴定,并对其发酵液进行酶学性质初步研究。结果表明,该菌被鉴定为皮氏类芽孢杆菌（Paenibacillus peoriae）,产蛋白酶的最适反应pH值为7.0,最适温度为40 ℃。在pH5.0～7.0之间、温度0～40 ℃时酶活稳定,金属离子Fe2+、Zn2+及Triten X-100能抑制蛋白酶活性,金属离子Mn2+及表面活性剂Tween-20、Tween-80能提高蛋白酶活性。     

南美白对虾虾头内源酶的分离纯化

对南美白对虾虾头的内源酶进行分离纯化及酶学性质的研究。利用正交正交试验优化了硫酸铵粗提内源酶最佳工艺条件:缓冲溶液pH6.8,硫酸铵一级沉淀饱和度20%,硫酸铵二级沉淀饱和度80%。虾头内源酶经硫酸铵分级沉淀后,再经Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱层析纯化,得到组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等3个酶活峰。对酶活最高的组分I进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱分析,表明组分Ⅰ中主要活性酶分子质量约为41.0kDa。凝胶层析分离组分Ⅰ最适作用pH为7.0～9.0,最适作用温度为60～70℃。     

Bacillus pumilus CN8菌株降解猪血Hb酶的分离纯化及酶学性质研究

Bacillus pumilus CN8菌株的发酵液,经离心分离得到粗酶液,再经硫酸铵盐析、透析,DEAE-Cellulose-52离子交换层析等步骤获得电泳纯的中性蛋白酶。得到比活达686.66U/mg的酶蛋白,纯化倍数为13.2,回收率为35.0%。SDS-PAGE测得其分子量大约为97000Da。该酶的最适作用pH为7.4,最适反应温度为42℃,在pH7.0~8.5范围内较稳定,在30~45℃比较稳定。经酶学性质测定,K+、Mg2+对酶活力具有保护作用,甘油对酶活具有抑制作用。     

嗜热古菌Thermococcus sp.HJ21产高温普鲁兰酶条件和酶学性质

对一株分离自热液口的超嗜热古菌(Thermococcus sp. HJ21)菌株产普鲁兰酶的条件及酶学性质进行了研究.结果发现:该菌株在18 h产酶量达到最高.在发酵温度为88 ℃、培养基初始pH 6.5,以及NaCl质量浓度为2.5 g/dL时,产酶较高.麦芽糖、酵母粉和蛋白胨有利于普鲁兰酶的产生.该酶的最适作用温度为95 ℃,在80～100 ℃之间仍可保持较高的酶活性;该酶具有较好的热稳定性,100 ℃保温2 h,仍有50%以上的残余酶活.该酶的最适作用pH为6.0,并且在pH 5.0～7.0之间可以保持较高酶活性;在pH 5.0～7.0之间较稳定,在pH 6.5时稳定性最好.Ca2+和Na+对普鲁兰酶具有较强的激活作用,而Al3+、Ni2+、Hg2+、Cu2+等则强烈抑制酶的活性.     

嗜热芽孢杆菌蛋白酶HS08的分离纯化研究

从高温土壤中分离得到的一株产耐热中性蛋白酶的嗜热芽孢杆菌,该菌分泌的胞外蛋白酶粗酶液经80%饱和度硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Superdax75凝胶层析分离纯化后,纯化倍数提高4．36倍,得率为5．3%,经SDS-PAGE电泳测得其分子量为30．6kDa。酶的最适温度与pH实验表明,该酶最适温度为65℃、最适pH为7．5,并且该酶在50℃时表现出1h以上的稳定性。该蛋白酶的活性受到丝氨酸族蛋白酶专一性抑制PMSF和金属离子螯合剂EDTA强烈抑制,Zn2+能提高酶活性,因此该蛋白酶为Zn2+激活的丝氨酸族蛋白酶。     

地衣芽孢杆菌弹性蛋白酶纯化和性质研究

用地衣芽孢杆菌发酵液制备弹性蛋白酶粗酶液,采用硫酸铵分级沉淀和Sephadex凝胶柱层析的方法分离纯化弹性蛋白酶,并对弹性蛋白酶的酶学性质进行研究。结果表明：弹性蛋白酶粗酶液经40%～70%饱和度的硫酸铵纯化后比活力提高到120U/mg,经凝胶柱层析纯化后比活力可达到292U/mg,纯化倍数为12.6,SDS-PAGE法证实弹性蛋白酶分子质量为29.5kD。对酶学性质的研究结果表明：弹性蛋白酶最适反应温度为55℃,最适反应pH值为7.4,以刚果红-弹性蛋白为底物,米氏常数Km为9.67mg/mL。低浓度金属离子Ca2+和K+对酶活力有促进作用,而Mg2+、Mn2+、Zn2+和Al3+对酶活力则有抑制作用。     

低温β-半乳糖苷酶分离纯化及酶学性质研究

对来自新疆天山冻土的Rahnella sp.R3所产的胞内低温β-半乳糖苷酶进行纯化,并对其酶学性质进行研究。采用硫酸铵分级沉淀、Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析、Q Sepharose High Performance阴离子交换层析、Sephacryl S-200High Resolution凝胶过滤层析,得到电泳纯酶。酶的活性回收率为21.3%,纯化倍数为35.6,比酶活由1.28U/mg提高到45.54U/mg。SDS-PAGE电泳显示其表观分子量为57.3kDa。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度为45℃,在15℃时的酶活为最高酶活的40%,4℃时的酶活为最高酶活的23%。该酶对热敏感,45℃保温45min酶活全部丧失。纯酶的最适pH为7.0,在pH 6.5~7.5时保持稳定。5 mmol/L Na+、Ca2+、Cu2+、Al 3+、Zn2+对酶活力有不同程度的抑制作用,其中Al 3+抑制作用最强,Na+、Ca2+抑制作用不明显。5 mmol/L Mg2+、K+对酶活力具有促进作用,其中Mg2+促进作用较强,使酶活提高到1.19倍。25℃以ONPG为底物的Vmax,Km值分别为7.19mol/(min·mL)、4.64mmol/L。     

微生物弹性蛋白酶催化动力学特性研究

研究了弹性蛋白酶的酶学性质与酶促反应动力学.研究表明,弹性蛋白酶的作用最适pH值与所用缓冲体系有关,在硼砂-硼酸缓冲体系中,最适pH值为7.8,而在Tris缓冲体系中,最适pH值为8.48;酶的作用最适温度为50℃,当温度高于60℃时,酶活性下降辐度较大,差异极显著.酶在pH3～7即酸性条件下,酶活较低,而在pH7～12时酶活较高,且趋于稳定.大部分金属离子对酶的活性有抑制作用,尤其是Ba+、Ca+、Al+和Cu+等金属离子可使酶的活性直线下降,而钠离子对酶的活性没有明显影响.采用Lineweaver-Burk方法,获得酶催化动力学参数Vmax=0.09512U/mL,km=0.00741m/ml,应用Michaelis-Menten方程求得弹性蛋白酶以弹性蛋白为底物的催化动力学方程为V=0.09512[S]/0.00741+[S].     

Bacillus sp.L1胞外蛋白酶EL1基因克隆及酶学性质分析

目的:对菌株Bacillus sp.L1分泌的胞外蛋白酶EL1进行分离纯化、基因克隆及酶学性质研究。方法:利用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析从菌株Bacillus sp.L1的发酵液中分离纯化出胞外酶EL1,对其进行了质谱分析、基因克隆及酶学性质研究。结果:质谱结果提示EL1属于丝氨酸蛋白酶,该酶基因开放阅读框为1326 bp,蛋白序列共441个氨基酸,氨基酸序列与菌株Bacillus stratosphericus分泌的丝氨酸蛋白酶(WP_007499449)同源性最高(98%)。该酶最适温度60℃,具有较好的热稳定性;最适pH8.0,在pH8.0时稳定性较好;Mn2+对其有一定的激活作用,Cu2+对其有一定的抑制作用。结论:Bacillus sp.L1分泌的胞外蛋白酶EL1具有较好的热稳定性,在碱溶液中可以保持较高的活力,具有潜在的工业应用价值。