单分子实时测序技术研究不同来源原料乳中群落组成及多样性

目的 采用三代单分子实时测序法(single molecule real time sequencing, SMRT)研究北京和内蒙古两地原料乳中的细菌群落组成及多样性,解析其携带污染菌的差异,为原料乳质量及风险评估提供基础数据。方法 收集北京和内蒙古两地春夏季和秋冬季的原料乳样品20份,采用SMRT技术对其进行基于16S rDNA基因全长的测序和多样性分析。在此基础上,对其进行了微生物相关功能性预测。结果 不同产地与不同采样季节原料乳中细菌群落的结构组成和相对丰度存在差异,假单胞菌属、不动杆菌属与乳球菌属是大部分样品中相对丰度最高的细菌,其中脆弱假单胞菌的相对丰度与原料乳冷链运输时间正相关。功能预测揭示了原料乳脂肪质量可能具有地区差异性,维生素与氨基酸质量可能具有季节差异性。结论 两产地原料乳菌群分析结果提示了原料乳潜在的食品安全风险,并且除致病菌风险之外耐药菌及耐药基因传播的风险同样不容忽视;此外,乳球菌属细菌具有开发作为益生菌的潜力。本研究结果为原料乳的质量安全监测评估和功能菌种挖掘提供了参考依据。     

基于454方法分析曲霉型豆豉发酵中细菌群落多样性

采用454高通量焦磷酸测序技术测定了曲霉型豆豉发酵周期8个不同阶段样品细菌多样性变化,研究不同阶段细菌群落变化及多样性。结果表明:细菌在门、纲两个水平各个不同样品主要微生物类别相似度很高,总共厚壁薄门、变形菌门、放线菌门三者占90%以上,但目、科、属水平差别较大,样品均一性最好的样品为HY04,有31个主要属,魏斯氏菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、乳球菌属、肠球菌属、假单胞菌在发酵不同阶段出现,丰度差异较大。证明曲霉型豆豉发酵过程中微生物群落结构复杂,主要菌群相对稳定。     

酸菜发酵过程中细菌群落结构变化及驱动机制

酸菜质量的标准化依赖于其发酵过程中的微生物群落结构的动态演替。本研究利用高通量测序技术研究酸菜发酵过程细菌群落结构组成的动态变化,以及理化因子的动态变化规律,揭示发酵环境与微生物群落结构之间的相关性,并进行功能预测和代谢通路分析。结果表明:酸菜发酵初期、中期和末期三阶段中初期S1阶段的Simpson指数显著高于S2、S3阶段(P<0.05),Shannon指数显著低于S2、S3阶段(P<0.05),表明发酵初期细菌群落的多样性较低。从9个酸菜样品中检测到的细菌种类隶属于6门、9纲、29目、47科、59属、83种。酸菜发酵中主要的优势菌门是厚壁菌门和变形菌门,假单胞菌、乳杆菌、肠杆菌、乳球菌为优势属。细菌群落结构在不同阶段具有明显差异,在发酵初期、中期和末期,厚壁菌门的相对丰度分别是10.61%,64.83%,77.51%,而变形菌门由84.18%降至33.19%,最终降到17.91%。假单胞菌属相对丰度由发酵初期65.36%,发酵中期21.21%降到发酵后期的7.10%,乳杆菌属由相对丰度小于1%,到发酵中期迅速增至58.06%,再到发酵后期增至67.65%。曲度乳杆菌是发...     

基于16S rDNA高通量测序方法比较新疆西北部地区乳品中微生物的多样性

为更加全面地了解新疆特色乳品中微生物多样性,比较不同动物来源的原奶和酸奶的细菌群落结构,运用高通量测序技术,对乳品中细菌16S r DNA V4-V5区测序,进而对新疆克州和塔城地区牛奶、驼奶、马奶、羊奶、酸牛奶、酸驼奶和酸马奶7种乳品中细菌群落组成和多样性进行分析。研究共获得539 557条有效序列,379个OTU。多样性分析表明,原奶样品中细菌Shannon-Wiener指数明显高于酸奶样品。微生物群落组成分析发现,不同乳品之间菌群组成差异较大。7种乳品中的菌群均以厚壁菌门和变形菌门为主,但原奶样品主要以变形菌门为主,而酸奶样品主要以厚壁菌门为主。在属水平上,牛奶主要以假单胞菌属(Pseudomonas)为主,驼奶主要以埃希菌属-志贺菌属(Escherichia-Shigella),马奶主要以明串珠菌属(Leuconostoc)为主,羊奶中的优势菌属为乳球菌属(Lactococcus),而酸牛奶、酸驼奶和酸马奶都是以乳杆菌属(Lactobacillus)为优势菌属。不同动物来源的原奶和酸奶样品中的微生物多样性存在显著差异,并且原奶中检测到的环境污染菌和致病菌(或条件致病菌)的丰度也相对较高。本研究结果将为准确评估乳品中的微生物群落对新疆地区少数民族健康的影响提供一定的数据基础。     

不同天然奶酪发酵剂和非发酵剂微生物多样性的高通量测序研究

为探究天然奶酪中发酵剂和非发酵剂微生物群落结构,应用Illumina-Hi Seq高通量测序技术,对江苏省主要销售的5组进口天然奶酪表皮和内部的细菌16Sr DNA序列V4区进行测序。所有样品的有效序列均在50000条以上,可操纵分类单元(OTU)数量为118~646。多样性指数分析和主成分分析结果表明,天然奶酪表皮比内部具有更高的细菌群落丰富度和不同的群落结构。样品中发酵剂细菌属为乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus),均位于相对丰度前五,总相对丰度在51~97%。样品中非发酵剂微生物分布于细菌厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)和软壁菌门(Tenericutes),相对丰度在2~16%。具有产耐热乳糖酶功能的非发酵剂微生物栖热菌属(Thermus,相对丰度0.02%~3.53%)在奶酪中首次被发现,为发掘天然奶酪中的微生物资源提供了可能。本研究也为解析天然奶酪中微生物与其风味质构的关系提供了基础数据。     

基于高通量测序技术分析豆腐乳中微生物多样性

采用高通量测序技术对4种不同来源发酵豆腐乳中微生物的多样性和丰度进行比对分析。结果表明,纯种发酵与自然发酵豆腐乳样品微生物菌群多样性差异较大,从不同豆腐乳样品中共检测得到3个优势细菌门（平均相对丰度＞1%）、6个优势真菌门、13个优势细菌属和19个优势真菌属;共有优势细菌属为假单胞菌属（Pseudomonas）、乳杆菌属（Lactobacillus）、透明颤菌属（Vitreoscilla）、魏斯氏菌属（Weissella）、不动杆菌属（Acinetobacter）和明串珠菌属（Leuconostoc）,其中,假单胞菌属在自然发酵豆腐乳中平均相对丰度最高（62.05%）;共有优势真菌属为酵母属（Saccharomyces）、曲霉属（Aspergillus）、德巴利氏酵母属（Debaryomyces）、短梗霉属（Aureobasidium）、假丝酵母属（Candida）和有孢圆酵母属（Torulaspora）,其中酵母属在纯种发酵豆腐乳中平均相对丰度最高（44.42%）。     

应用Illumina Miseq测序分析川西高原传统牦牛发酵酸奶中细菌多样性

为探究传统发酵牦牛酸奶中细菌群落结构的多样性,本文采用Illumina Miseq高通量测序对川西高原不同地区的传统自然发酵牦牛酸奶样品进行细菌群落结构分析。结果表明,测序样品数8个,共获得375236条优化序列,平均每个样品46905条,共有88条不同的OTU;样品GC的α-多样性指数最佳,细菌群落多样性最高且分布均匀;巴塘县的两个样品相对其它县占仅有的OTU数最多,为31;8个样品在门水平上,细菌的优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes),占总样本数量的98.33%~99.96%;在属水平上,主要细菌属为乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、巨型球菌属(Macrococcus)和魏斯氏菌属(Weissella),乳杆菌属(Lactobacillus)是所有样品的优势菌属,相对丰度占比69.31%~99.92%;根据样品的Heatmap和PCoA分析8份样品在属水平和种水平上的群落结构相似,具有细微的差异,不同地区的牦牛酸奶中的群落结构具有差异性和相似性。本研究结果为川西高原传统发酵牦牛酸奶微生物资源开发应用提供了理论依据。     

基于高通量测序的雪茄烟微生物群落结构和多样性分析

为探究雪茄烟产品细菌和真菌群落的结构和多样性,采用高通量测序技术对10个雪茄烟样品中细菌16S rRNA基因和真菌ITS基因进行测序检测,根据测序数据进行微生物物种丰度分析、α多样性分析、菌群结构分析和聚类分析。结果表明:(1)所分析的雪茄烟样品中细菌和真菌的多样性丰富,共检出360个细菌属和49个真菌属,其中细菌和真菌群落多样性最高的样品分别是HNL9和WG。(2)所分析的雪茄烟样品的优势菌门为厚壁菌门和子囊菌门,优势菌属为葡萄球菌属、不动杆菌属、假单胞菌属和曲霉属。(3)不同样品中细菌和真菌群落多样性和结构存在显著差异,聚类分析显示来自同一产地国的GXB和MT样品菌群分布比较相似。     

暗纹东方鲀冷藏期间细菌群落结构与功能变化

目的：探究暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）冷藏期间的微生物群落结构与功能变化规律，明确贮藏过程的优势菌属。方法：通过高通量测序技术研究冷藏期间（4℃，8 d）暗纹东方鲀细菌群落结构组成与变化规律，利用Tax4Fun2软件进行细菌群落功能预测，并测定其挥发性盐基氮（Total Volatile Basic-N,TVB-N）、pH、感官评分等指标变化。结果：高通量测序表明贮藏期间样品细菌群落发生显著变化，初期的主要菌属有不动杆菌属（Acinetobacter）、乳杆菌属（Lactobacillus）、气单胞菌属（Aeromonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）等，贮藏后期假单胞菌属（Pseudomonas）的相对丰度增至91.7%以上，成为优势菌属。贮藏初期α多样性指数较高，贮藏后期明显降低。细菌群落功能预测结果显示贮藏后期的氨基酸代谢、细胞交流、膜运输等功能通路丰度升高。贮藏后期样品pH、挥发性盐基氮值、菌落总数呈上升趋势，感官评分呈下降趋势。结论：样品贮藏过程中，微生物群落结构与功能发生明显演替，假单胞菌属（Pseudomonas）是贮藏过程中的优势菌属；该结...     

冷鲜猪肉贮藏过程中细菌群落结构演替规律分析

为探究冷鲜猪肉在贮藏过程中细菌群落结构的演替规律。将新鲜猪肉使用非密封包装进行低温贮藏,每天取样1次(共10 d),测定每日样品的pH值和挥发性盐基氮含量,并通过16S r DNA高通量测序技术分析细菌的多样性、群落组成和演替规律,探究细菌群落变化与腐败指标之间的相关性。通过Alpha多样性分析可知,猪肉在冷藏过程中细菌丰度和多样性总体上呈"三级台阶"的下降,丰度和多样性最高点在D3。在门水平上优势菌为变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门;在目水平上优势菌为假单胞菌目和肠杆菌目;在属水平上优势菌为假单胞菌属、不动杆菌属和泛菌属。对各菌属相对丰度变化的分析表明假单胞菌属,与肠杆菌属、泛菌属之间存在互生关系。细菌相对丰度和腐败指标的相关性表明猪肉腐败过程中拉乌尔菌属和醋杆菌属的相对丰度与挥发性盐基氮含量具有较强的相关性。     

Single-molecule real-time sequencing reveals differences in bacterial diversity in raw milk in different regions and seasons in China

The quality of raw milk is a key factor influencing the whole dairy processing chain. The richness and diversity of bacteria in raw milk affect its quality and safety. However, traditional microbial detection methods mainly depend on the known microbe culture and are often time consuming. Thus, the development of efficient ways for supervising any possible microbiological contamination is desiderated. In the current work, single-molecule real-time (SMRT) sequencing, developed by Pacific Biosciences (PacBio), was applied to acquire long reads and applied for discrimination of bacteria at species level. Forty samples of raw milk obtained from Beijing, Hebei, Inner Mongolia, Shanghai, and Guangdong in China during summer, autumn, and winter were investigated. Among 35 bacteria species identified in these samples, Acinetobacter albensis, Pseudomonas gessardii, Pseudomonas weihenstephanensis, and Rahnella inusitata were the bacteria with the highest relative abundance in the overall sample, whereas the bacteria with the highest relative abundance in raw milk samples of different origins and seasons are different. Significant differences in bacterial richness and bacterial community diversity in raw milk grouped according to different production areas and different sampling seasons were confirmed by Welch's t-test. Interestingly, the transport distance and transport time positively correlated with the relative abundance of Pseudomonas weihenstephanensis, suggesting that the content of this bacteria was expected to be a standard for evaluating the freshness of raw milk. Pathogens Bacillus cereus and Klebsiella pneumoniae were detected in most samples, indicating that the raw milk was at risk of contamination by pathogenic bacteria. Moreover, the findings of this study provide important evidence for quality and safety monitoring and biological control of raw milk.     

咸丰和当阳地区鲊广椒细菌群落结构差异性研究

采用Illumina MiSeq高通量测序技术对咸丰地区鲊广椒细菌群落结构进行解析,同时结合之前研究报道的当阳地区鲊广椒样品分析数据,探究不同地区鲊广椒菌群结构的异同。结果表明,咸丰地区鲊广椒优势细菌门为硬壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）,优势细菌属为乳酸杆菌属（Lactobacillus）、片球菌属（Pediococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、盐单胞菌属（Halomonas）和明串珠菌属（Leukonostoc）。其细菌的丰度和多样性均极显著高于当阳地区（P＜0.01）,同时,一些低丰度的菌群在两个地区的样品中存在显著差异（P＜0.05）,乳杆菌属和片球菌属为主要优势菌属和核心菌属。此外,两地区鲊广椒中均广泛分布有肠杆菌属（Enterobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）和芽孢杆菌属（Bacillus）等致病共栖菌。相关性分析结果表明,鲊广椒发酵菌群彼此间存在密切的相关关系,其制作和生产需要多种微生物的协调作用。     

基于16S rDNA高通量测序分析水牛初乳与常乳中细菌多样性

目的:利用16S rDNA高通量测序研究广西水牛研究所种畜厂三品杂水牛初乳与常乳的细菌多样性。方法:提取当天采集的生水牛乳样本的细菌总DNA,PCR扩增其16S rDNA,利用纯化后的扩增片段构建其菌群的16S rDNA文库,采用Miseq PE300平台进行高通量测序以及BLAST比对。结果:初乳组样本共得到19个门,292个属和437个种。而常乳两组样本共得到7个门,203个细菌属和330个细菌种,初乳组的细菌多样性高于常乳组。初乳组中的优势菌属为金黄杆菌属（Chryseobacterium）、不动杆菌属（Acinetobacter）、假单胞菌属（Pseusomonas）,而常乳组中的优势菌则为金黄杆菌属（Chryseobacterium）、乳球菌属（Lactococcus）、肠球菌属（Enterococcus）。样本层级聚类显示:初乳组与常乳组组间群落差异不显著。PCA与PLS-DA分析表明:两组样本组间菌群结构差异显著。结论:三品杂水牛初乳与常乳均呈现较丰富的多样性,常乳组中细菌多样性显著高于初乳组。     

基于Illumina MiSeq和IonS5 XL测序对原料乳中微生物多样性的比较分析

不同的高通量测序平台各有优劣,针对研究对象选择合适的测序平台,对微生物多样性研究具有重要意义。以原料乳中的细菌为研究对象,采用Illumina MiSeq和IonS5 XL两种测序平台对细菌的V4—V5区进行扩增测序,探讨两种不同的测序平台在原料乳微生物多样性应用中的适用性。结果显示:两个测序平台的原始测序数据经质控后均可满足实验需求;IonS5 XL测序在不同分类水平上的注释物种数、alpha多样性、稀释曲线和物种丰度等级曲线方面的结果优于Illumina MiSeq测序,显示出原料乳中较高的群落丰富度;Illumina MiSeq测序和IonS5 XL测序均检出相同的优势菌门与优势菌属;Venn图和PCA分析显示,Illumina MiSeq测序相较于IonS5 XL测序具有更好的生物学重复性,在测序稳定性方面具有优势。后期如能加大平行样本的统计,针对重复性进行改进,IonS5 XL测序也将在乳品微生物多样性研究中具有很大的应用空间。     

阿尤恩地区自然发酵牛乳中乳酸菌分离鉴定及多样性研究

为了分离、保藏自然发酵乳中乳酸菌菌种,丰富自然发酵乳中乳酸菌多样性信息。本文采用传统的纯培养分离方法和宏基因组16S rRNA基因测序技术对阿尤恩地区自然发酵牛乳的乳酸菌多样性进行研究。纯培养结果表明:5份自然发酵牛乳中共分离出111株乳酸菌,鉴定为5个属10个种,其中Lactococcus lactis,占总分离株的45.95%;宏基因组测序结果发现,5份样品中的细菌归属于8个门、66个属和131个种,其中优势菌门为Firmicutes(69.63%),优势菌属为Lactococcus(31.80%),优势菌种同样为Lactococcus lactis(22.95%),另外还检测到含量较高的Streptococcus thermophilus(17.12%)、Lactobacillus helveticus(14.44%)等菌种。通过分析发现,Lactococcus lactis为阿尤恩地区5份自然发酵牛乳样品的优势菌种,并且自然发酵牛乳样品中细菌种类丰富,样品间细菌组成存在相似性和差异性。     

西藏不同产区曲拉细菌群落结构的比较分析

为探究西藏不同产区传统发酵乳制品曲拉中细菌多样性及其微生物安全性,该研究通过Illumina MiSeq测序平台,对西藏拉萨(LS)、日喀则(RKZ)、山南(SN)、昌都(CD)、林芝(LZ)、那曲(NQ)和阿里(AL)共7个地区的曲拉样品细菌多样性及群落结构进行了系统分析。结果表明,曲拉具有高度的细菌多样性,并且不同地区的样品存在一定的共性和差异。在门的水平上,7个地区的优势菌均集中在厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria),其相对丰度分别在(12.82±5.63)%^96.54±1.39%和(3.46±1.39)%^75.09±9.37%。相比门的种类,拉萨(LS)最多,为24个门,阿里(AL)最少,为2个门。在属的水平上,拉萨地区(LS)曲拉样品中的优势菌属为雷尔氏菌属(Ralstonia)、假单胞菌属(Pseudomonas)和苍白杆菌属(Ochrobactrum),其相对丰度分别为(17.25±7.05)%、(16.05±3.22)%和(9.52±3.19)%;其他6个产地的曲拉样品中优势菌属主要为乳球菌属(Lactococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus),其相对丰度分别为(85.13±2.99)%^25.82±1.42%和(4.15±1.38)%^57.21±3.11%;而在属的种类上,LS最多,为409个属,AL最少,为15个属。聚类分析显示,不同曲拉样本的菌群与地理位置存在一定关系,同一个采样区的样本具有一定的聚类趋势,同时发现LZ、RKZ和CD可聚为一类,而其他4个地区的样品较为离散,且各自独立。     

建始地区酸豇豆盐水细菌多样性及乳酸菌分离鉴定

该研究采用MiSeq高通量测序技术对酸豇豆盐水的细菌多样性进行了解析,并通过纯培养方式分离了其中的乳酸菌。结果发现,细菌以硬壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）为主,平均相对含量分别为84.41%和10.52%;细菌属以乳酸杆菌属（Lactobacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和片球菌属（Pediococcus）为主,平均相对含量分别为57.02%、9.33%、7.07%、4.73%和3.40%;发现44个操作分类单元（OTU）存在于所有样品中,所包括序列占总序列数的25.06%,其中有6个、11个和13个分别被鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas）、魏斯氏菌属（Weissella）和乳酸杆菌属（Lactobacillus）,所含序列平均含量分别为4.61%、4.97%和14.46%;通过纯培养共分离出了13株乳酸菌,其中12株被鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。由此可见,乳酸杆菌为建始地区酸豇豆盐水中的优势细菌,且乳酸杆菌主要为植物乳杆菌。