基于双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术的核酸杂交试纸条快速检测驴肉中的马源性成分

目的：建立快速、操作简单、价格相对低廉的驴肉中马源性成分快速可视化检测技术。方法：采用双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术(RPA)与核酸杂交试纸条相结合。针对马线粒体细胞色素b(cytb)基因设计RPA引物,引物包含3个功能区域,特异性绑定区域用于RPA扩增反应,spacer 9用于终止聚合酶的扩增,单链拖尾区域用于与试纸条上的探针杂交。这对特殊引物使RPA扩增子带有两个单链拖尾序列,这两个单链拖尾序列可以特异性地被金纳米探针和试纸条上的检测探针识别并捕获,形成一条肉眼可见的红色条带。整个扩增(15 min)和检测(5 min)过程在20 min即可完成,无需复杂的设备,仅需要一台数字化水浴锅。为进一步验证该方法的实际应用性能,对市面上的20份驴肉产品进行测定,并采用PCR(Polymerase Chain Reaction,PCR)结合琼脂糖凝胶电泳的方法进行验证。结果：该方法对马肉的检测限达到0.01%,且仅对马肉核酸有特异性扩增,与其他8个物种的核酸均无交叉反应,20份驴肉样品中有2份存在马源性成分。结论：该方法特异性强、灵敏度高,可实现驴肉中马源性成分的可视化快速检测。     

交叉引物等温扩增检测猪肉源性成分

肉制品掺假现象已成为我国食品行业重点关注的问题。本研究使用交叉引物恒温扩增技术(Cross priming amplification,CPA)和核酸试纸条检测相结合的方法快速检测肉制品中猪肉成分。对猪线粒体的D-loop基因序列设计特异性的引物和探针,通过优化引物浓度及反应条件,确立最佳反应体系。实验结果表明,CPA扩增系统对猪源性成分的检测特异性良好,对单猪源性成分的检出限为1 ng/μL,对混合肉制品中猪源性成分的检出比例为10%(相当于10 ng/μL)。同时核酸试纸条可以快速检测CPA扩增产物,结果与凝胶电泳系统检测保持一致。本研究建立的CPA-核酸试纸条检测方法是一种特异、高效的肉制品中猪肉成分检测方法,可以为肉制品质量控制提供有效的新手段。     

可视化核酸试纸条法快速检测肉及肉制品中鸭源成分

建立肉及肉制品中鸭源成分快速检测的可视化核酸试纸条法。设计鸭特异性引物,建立鸭成分检测可视化核酸试纸条方法,验证方法的特异性与灵敏度,并对市售肉及肉制品进行检测。该方法检测灵敏度0.1%,能够从鸭肉样品扩增出291 bp特异性DNA片段,而鸡、鹌鹑、猪、马、牛、羊、驴、鹿、骆驼、胡萝卜、白菜等动植物样品无扩增条带。建立的鸭源成分检测可视化核酸试纸条法特异性好,灵敏度高,简便,快速,是鸭源成分检测的有效方法。     

北京地区牛、羊肉片中鸭、鸡、猪源性成分调查

建立生肉制品中鸭、鸡、猪源性成分的荧光PCR检测方法,对北京地区出售的牛、羊肉片进行成分调查。方法 合成检测鸭、鸡、猪源性成分的特异性引物和探针,建立实时荧光PCR检测方法,测定方法的特异性、灵敏度,在北京部分超市、农贸市场、餐馆采集牛、羊肉片进行成分调查。结果 所建立的实时荧光PCR方法对鸭、鸡、猪源性成分具有较好特异性,与常见食用肉类DNA在Ct 30以内无交叉反应;对混合肉中鸭、鸡、猪成分DNA的检出限是0.1%。北京市场上采集的86份牛、羊肉片中,30份检出上述成分,占34.9%;羊肉片的掺假率高于牛肉片;农贸市场采集样品掺假率明显高于超市和餐馆。结论 所建生肉制品中鸭、鸡、猪源性成分的检测方法简单、特异,对样品的检测结果显示,北京市售牛、羊肉中存在掺入鸭、鸡、猪肉的现象。     

基于重组酶等温扩增技术快速检测生鲜肉中猪源性成分

目的建立重组酶介导等温扩增技术快速检测猪肉中猪源性成分的方法。方法应用重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),根据猪源性线粒体细胞色素b(Cytb)基因序列设计2对RPA引物,筛选了1对可用于扩增的引物,建立基于重组酶介导的等温扩增技术的检测方法,并对该方法进行扩增温度、特异性和灵敏性验证。结果 30℃等温扩增条件下,RPA引物的特异性良好,灵敏性可达0.1ng/μL。结论本研究成功建立了猪源性肉制品的等温扩增方法,该方法快速简便,具有较高的特异性和灵敏性,适用于市售生鲜肉中猪源性成分的快速鉴定。     

同时检测速冻食品中鸡、鸭、猪和牛源性成分实时荧光聚合酶链式反应方法的建立及应用

以鸡转化生长因子β-3(transforming growth factor beta-3,TGFB3)基因、猪朊蛋白(prion protein,PRNP)基因和鸭、牛生长激素(growth hormone,GH)基因为靶基因,设计合成特异性引物和TaqMan探针,通过对实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)体系和反应条件的优化,建立同时检测速冻食品中鸡、鸭、猪和牛源性成分的实时荧光PCR检测方法。结果表明:本研究所建立的方法只在鸡、鸭、猪或牛源性成分存在时才产生特异性扩增曲线,表明该方法具有良好的特异性;且对鸡、鸭、猪和牛源性成分的最低检测质量浓度分别可达到10.0、1.0、10.0、10.0 pg/μL,具有良好的灵敏性;应用建立的检测方法对市售34份速冻食品鸡、鸭、猪和牛源性成分进行同时检测,能够实现对速冻食品中4种动物源性成分的有效检测,进一步分析发现,15份速冻食品源性成分测定结果与外包装标注成分不一致。本研究所建立的同时检测速冻食品中鸡、鸭、猪和牛源性成分的实时荧光PCR检测方法具有良好的特异性和灵敏性,且操作简单、适用范围广,能够满足日常检测需求。     

用于五种动物源性成分快速检测的离心式微流控芯片系统研制

基于离心力驱动原理与重组酶介导扩增技术,研制了一套用于牛、羊、猪、鸭、鸡源性成分快速检测的离心式微流控芯片系统。设计制作了扇形微流控芯片和配套使用的密封盖片、芯片托盘装置,同时搭建了集恒温控制平台、流体控制模块和光电检测模块于一体的便携式微流控速测仪,可实现动物源性成分的核酸恒温扩增及荧光检测。每次可同时检测5个样本,每个样本可同时检测5种指标。考察结果显示,离心式微流控芯片系统可检出牛、羊、猪、鸭、鸡源性成分的最小质量分数分别为1%、1%、0.1%、0.1%、1%,能够在30 min内实现半定量检测,具有快速、自动、高通量的特点,显示了离心式微流控芯片可快速检测肉制品掺伪的潜力。     

利用重组酶聚合酶扩增技术快速鉴定肉及肉制品中的猪源性成分

根据家猪线粒体细胞色素b的核苷酸序列设计和筛选实时荧光定量重组酶聚合酶扩增(Real time recombinase polymerase amplification,real-time RPA)反应所需的引物和探针,优化反应参数(Mg~(2+)和引物浓度),建立了一套利用real-time RPA技术进行肉及肉制品中猪源性成分的鉴定方法。应用此方法可以检测出肉及肉制品中低至0.2%的猪源性成分,且能够在恒温的条件下(40℃)15min中内完成反应,克服了传统聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术需要精密温度循环控制设备的局限性,是一种新型、简单、高效的检测方法,对实现快捷便携式的猪源性成分鉴定检测具有重要的意义。     

重组酶介导等温扩增技术快速检测牛肉及 牛肉制品中的牛源性成分

目的建立重组酶介导等温扩增技术快速检测牛肉及牛肉制品中牛源性成分的方法。方法应用重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),根据牛源性线粒体细胞色素b(Cytb)基因序列设计筛选了一对可用于扩增的引物,建立基于重组酶介导的等温扩增技术检测方法,并对该方法进行扩增温度、特异性和灵敏性验证。结果 40℃等温扩增条件下,所设计的引物的特异性为100%,该检测方法的灵敏性可达0.1 ng/μL。结论本研究成功建立了牛源性肉制品的等温扩增方法,该方法快速简便,具有较高的特异性和灵敏性,适用于市售生鲜肉制品及加工肉制品中牛源性成分的鉴定。     

种属特异性PCR法鉴别罐头食品中猪、牛、羊、鸡、鸭源性成分

建立适用于肉类罐头等长时间高温加工食品中猪、牛、羊、鸡、鸭5种动物源成分种属特异性PCR鉴别方法。通过使用猪、牛、羊、鸡、鸭的种属特异性引物,对5种动物的总DNA模板进行PCR扩增,得到分别为212、147、202、131、201 bp的扩增产物,将测序结果在美国国家生物技术信息中心(US National Center for Biotechnology Information,NCBI)进行BLAST比对确认实验的准确性,并对市售罐头样品进行检测。该方法5种动物引物种属特异性良好,对猪、牛、羊、鸭源性成分的检测灵敏度可达1%,对鸡源性成分的检测灵敏度为2.5%。在对市售肉类罐头样品的检测中,6.6%样品与标签标注结果不符。该方法操作简便,成本低,结果准确可靠,可广泛用于肉类罐头食品和长时间高温加工食品中猪、牛、羊、鸡、鸭5种动物源成分的鉴别,具有十分广泛的实际应用价值。     

可视化LAMP检测常见肉制品中猪肉成分

根据GenBank中公布的猪线粒体色素细胞b基因序列设计6 条特异性环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）引物,通过简化线粒体DNA提取步骤,优化反应体系,以常见的牛、羊、鸡、鸭、马、驴肉为阴性对照验证该方法的特异性,掺假率梯度稀释以验证该LAMP法的最低检测限,建立常见肉制品中猪肉成分的可视化LAMP检测方法。结果表明：该方法提取目的基因操作简单、稳定,该可视化LAMP检测法以4-(2-吡啶偶氮)-间苯二酚钠盐为指示剂,能准确检测出常见肉类中猪肉是否掺杂,检测结果肉眼可见,灵敏度为10 pg/μL。     

基于COI序列的DNA微条形码技术鉴别熟肉制品中11种肉掺假的研究

建立并优化了基于COI序列的DNA微条形码技术（mini-barcoding）检测熟肉制品中11种常见肉类掺假的方法。样品经超声与真空冷冻干燥处理,提取DNA模板和PCR扩增后,目标扩增物经切胶纯化后进行克隆测序,并将测序结果提交GenBank数据库Blast比对。筛选出适合猪、牛、羊、鸡、鸭、鸽子、马、驴、鹅、兔、鼠11种肉类的扩增的通用引物COI-A,对PCR扩增条件进行优化,并建立18个掺假模式,对低经济价值肉类（猪、鸡、鸭、马、驴、鼠）的掺入的最低比例进行考察。结果表明:11种熟肉的DNA经通用引物COI-A扩增后,其扩增效率均为100%,18个掺假模式中,牛肉和羊肉中掺入6种低经济价值肉类的最低检出比例为5%,而掺入鸡肉的最低检出比例为10%,而鹅肉、鸽子肉和兔肉的掺假模式中最低检出比例为10%;利用本方法检测30批次市售样品,发现有18批次的熟肉制品存在掺假情况。该方法前处理简单,灵敏度合适,重现性好,可作为高经济价值熟肉制品中掺假低经济价值肉类的有效检测方法。     

2013年苏州地区肉及其制品掺假情况调查

了解苏州地区肉及其制品的掺假情况,通过对肉类种源与标签明示肉源进行比对,鉴别摻假食品,为加强食品标签管理提供依据。方法 运用自建的动物源性食品种源判定Taqman实时荧光PCR检测体系对苏州地区的肉及其制品进行种源判定,与标签明示肉源进行比对,鉴别摻假食品。结果 本次调查共检验涉及32个生产单位的90份样品,总不符合率为25.6%(23/90)。检测的44份牛肉及其制品中有12份与标签不符,8份用猪肉部分替代牛肉,1份以鸭肉部分代替牛肉进行销售;此外有3份不含有牛肉成分,存在猪、鸡、鸭源性肉类之外的肉类成分。共检测羊肉及其制品16份,有2份用鸭肉代替羊肉出售,3份羊肉样品中掺入了部分猪成分,其中1份样品还存在单个样品掺杂两种外源肉类的现象(猪源性和鸭源性)。检测猪肉及其制品19份,其中2份样品含有标签未注明的鸡肉成分。在所检测的11份混合肉类样品中有4份成分与标签不符,主要是以廉价的鸡肉取代/部分取代相对高价的牛肉和猪肉。结论 肉制品掺假情况明显,用猪肉、鸭肉部分代替牛肉和羊肉仍是主要的掺假手段,牛肉掺假样品主要是熟制牛肉制品,而火锅食用羊肉卷样品则是羊肉掺假高危品,开展肉制品摻假检测对规范肉制品市场具有积极意义。此外,3份未知种源成分的牛肉样品提示在现有检测基础上还需扩大检测范围,防患于未然。     

Quantitative Detection of Poultry in Cooked Meat Products

ABSTRACT: There is a growing awareness of perceived harm from meat species adulteration, both intentional and accidental. The present study developed a monoclonal antibody (Mab)-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the quantitative detection of chicken and turkey meat adulterated in cooked (100 °C, 15 min) mammalian meat. The specificity of Mab 5D2 to different species (pork, beef, lamb, deer, horse, duck, chicken, and turkey) and tissues (serum, gizzard, heart, and liver) was studied by noncompetitive ELISA. The detection of cooked chicken in beef, and turkey in pork was accomplished by competitive and noncompetitive ELISAs. Both ELISAs were optimized to quantify cooked poultry in red meats. The new Mab-based ELISAs enabled the detection of cooked poultry in red meats at levels as low as 1% (v/v) or better. The correlation ( r > 0.994) between chicken or turkey concentrations and ELISA signals permitted the quantification of poultry adulterants in cooked non-poultry meats.     

基于PCR技术的肉类成分溯源鉴定方法研究进展

近几年屡屡曝光的食品安全事故引起了社会的广泛关注,食品安全已经成为社会共同关注的问题,肉类掺假造假现象更是层出不穷,其中用低价鸡肉、鸭肉、猪肉等掺入、冒充牛羊肉成为主要的掺假方式。国内外进行肉类掺假鉴定主要以核酸作为靶标,核酸鉴定也是物种鉴别最常用、最核心的方法,以DNA检测为基础建立起来的DNA条形码、多重PCR、荧光定量PCR、荧光探针等技术也得到空前发展和广泛应用。我国针对动物源性成分检测也制定了相关国家标准和行业标准,但大多现行标准中基于DNA检测建立的PCR技术只能检测单一物种,滞后于技术的发展。目前,基于PCR发展起来的衍生技术凭借其高灵敏度、强特异性和高通量等优势在动物源性成分检测工作中显示出巨大潜力,也是肉类成分鉴定未来的重要方向。本文综述了PCR技术在肉类检测中的研究概况和现行标准的技术概况,以期为肉类成分鉴定研究提供信息。     

TaqMan probe real‐time polymerase chain reaction targeting the ATPase 6 gene for the detection of pork adulteration in meat and meatballs

We developed an assay for detecting pork adulteration in meat and meatballs using real‐time polymerase chain reaction involving specific primers and a TaqMan probe targeting the porcine mitochondrial (mt) ATPase 6 gene. We proved the specificity of the probe by showing no amplification from DNA isolated from six different meat‐providing species: cattle, dog, mouse, chicken, goat, and horse. On the contrary, DNA isolated from pork was positive for amplification, with a Ct (threshold cycle) of 18.69 using a standard amount of DNA template (50 ng). The presence of matrix and food processing steps in meatball sample had no influence on the specificity of the probe. The developed technique also has a good repeatability (CV, coefficient of variation = 3.86% for meat and 5.07% for meatballs), showing good linearity and sensitivity, with a limit of detection up to 5 pg of pork total DNA, which equivalent to approximately 6.8 copies of pork mtDNA. In addition, the analysis of spiked pork in beef meatballs showed that the method could determine up to 1% pork contamination. Moreover, the system was successfully applied to detect pork adulteration in commercial meatballs by detecting the presence of pork DNA in two samples.     

HDA法用于检测肉中金黄色葡萄球菌的研究

本文研究了猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌的依赖解旋酶恒温基因扩增检测方法mDA法）,以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶ruc粥基因为目的基因,设计一对特异性引物,优化反应条件uvrDhelicase、T4gp32的浓度,通过赖解旋酶恒温基因扩增方法直接检测猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌,扩增产物通过电泳进行检测。结果表明,HDA法检测肉中金黄色葡萄球菌的特异性强,试验涉及的其它菌株未发生扩增,只有金黄色葡萄球菌得到与设计序列长度一致的216bp基因片段,检出限为10^5CFU／g,优化确定UvrDhelicase、T4gp32的终浓度分别为0．1gg、5．0gg,该方法用于检测猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌的灵敏度高,耗时短,为猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌的快速检测提供了新的方法,也为其它食品中金黄色葡萄球菌的快速检测奠定了基础。     

核酸检测技术检测肉类种源研究进展

肉及肉制品是人类重要的食物来源, 为人体提供必要的营养素。但是以经济为目的的肉制品掺假, 是食品安全中屡禁不止的全球性问题。快速、准确、有效的检测技术是有效监督肉类掺假的关键。本文综述了核酸检测技术中热循环扩增技术(如普通PCR、实时PCR、多重PCR)和等温扩增技术[如环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)技术、滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)技术、交叉引物等温扩增(cross prime amplification, CPA)技术等]的原理及在肉类种源鉴别中的应用。提出梯型熔解温度等温扩增(ladder-shape melting temperature isothermal amplification, LMTIA)技术, 以期推进核酸检测技术的研究及在肉制品领域的应用。在肉类种源的检测中, 实时荧光定量PCR技术、跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification, SRCA)技术等均能检出0.01%的掺伪, 可用于定量检测, 表明这些核酸技术在肉类种源检测中有很好的应用前景。     

气相色谱法测定猪肉馅中鸭肉掺杂比例

目的:有效打击市场上猪肉馅掺杂行为。方法:基于气相色谱法分析不同肉类中的特征脂肪酸种类以及含量,手动建立猪肉、鸭肉的标准指纹图谱,分析猪肉馅中掺入10%,30%,50%,70%的鸭肉掺杂样品色谱图;对掺杂试验进行模拟,建立掺杂量0%,10%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%与掺杂肉样的特征脂肪酸的预测回归模型,并对不同掺杂量的肉馅进行验证实验。结果:试验回归预测模型的R2值＞0.99,在验证实验过程中,掺杂样品的最低检出限为0.5%。结论:试验建立的掺杂预测模型有很好的精确度和准确度。