基于重组酶等温扩增技术快速检测生鲜肉中猪源性成分

目的建立重组酶介导等温扩增技术快速检测猪肉中猪源性成分的方法。方法应用重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),根据猪源性线粒体细胞色素b(Cytb)基因序列设计2对RPA引物,筛选了1对可用于扩增的引物,建立基于重组酶介导的等温扩增技术的检测方法,并对该方法进行扩增温度、特异性和灵敏性验证。结果 30℃等温扩增条件下,RPA引物的特异性良好,灵敏性可达0.1ng/μL。结论本研究成功建立了猪源性肉制品的等温扩增方法,该方法快速简便,具有较高的特异性和灵敏性,适用于市售生鲜肉中猪源性成分的快速鉴定。     

双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术结合核酸杂交侧流条快速检测牛肉中的鸡、鸭、猪源性成分

目的? 建立快速、简便、经济的双拖尾重组聚合酶恒温扩增结合核酸杂交试纸条快速检测牛肉中鸡源、鸭源、猪源性成分的可视化检测技术。方法? 采用多重双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术(multiplex recombinase polymerase amplification,mRPA)与核酸杂交试纸条相结合。对鸡、鸭、猪线粒体D环区域设计特异性拖尾RPA引物,扩增出双拖尾的RPA产物。鸡、鸭、猪3个物种RPA产物的拖尾序列分别与红、黄、蓝三种颜色的金纳米探针和试纸条上的检测探针杂交,形成肉眼可见的红、黄、蓝三色条带,整个RPA扩增(15 min)和试纸条检测(5 min)过程在20 min内即可完成。结果? 该方法对牛肉中鸡、鸭、猪肉的检测限达0.01%,且仅对鸡、鸭、猪肉DNA有特异性,与其他10个物种的DNA均无交叉反应。采集50份市售牛肉样品,使用该方法进行真实性检测:10份牛肉干、10份生牛肉、10份酱牛肉中未检测出其他动物源性成分,10份牛肉馅料中检测出1份含猪源性成分,10份牛肉片中检测出1份含鸡源性成分。该方法与PCR结合凝胶电泳的检测结果具有很好的一致性。结论? 双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术结合核酸杂交试纸条具有特异性强、灵敏度高,操作简单的优点,可实现牛肉中鸡、鸭、猪源性成分的同时可视化快速检测。     

可视化核酸试纸条法快速检测肉及肉制品中鸭源成分

建立肉及肉制品中鸭源成分快速检测的可视化核酸试纸条法。设计鸭特异性引物,建立鸭成分检测可视化核酸试纸条方法,验证方法的特异性与灵敏度,并对市售肉及肉制品进行检测。该方法检测灵敏度0.1%,能够从鸭肉样品扩增出291 bp特异性DNA片段,而鸡、鹌鹑、猪、马、牛、羊、驴、鹿、骆驼、胡萝卜、白菜等动植物样品无扩增条带。建立的鸭源成分检测可视化核酸试纸条法特异性好,灵敏度高,简便,快速,是鸭源成分检测的有效方法。     

重组酶介导等温扩增技术快速检测牛肉及 牛肉制品中的牛源性成分

目的建立重组酶介导等温扩增技术快速检测牛肉及牛肉制品中牛源性成分的方法。方法应用重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),根据牛源性线粒体细胞色素b(Cytb)基因序列设计筛选了一对可用于扩增的引物,建立基于重组酶介导的等温扩增技术检测方法,并对该方法进行扩增温度、特异性和灵敏性验证。结果 40℃等温扩增条件下,所设计的引物的特异性为100%,该检测方法的灵敏性可达0.1 ng/μL。结论本研究成功建立了牛源性肉制品的等温扩增方法,该方法快速简便,具有较高的特异性和灵敏性,适用于市售生鲜肉制品及加工肉制品中牛源性成分的鉴定。     

实时荧光PCR定量检测肉制品中猪源性成分

为了准确可靠地对肉制品中猪源性成分进行定量检测,通过生物信息学方法筛选到猪细胞核单拷贝基因（carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 2-like,CACA）。以CACA基因为扩增靶标,设计了特异性引物、TaqMan探针,建立了基于实时荧光定量PCR技术检测猪肉含量的方法。实验结果表明,该方法具有良好的种外特异性和种内稳定性,在20~0.032 ng/μL的DNA浓度范围内,模板DNA和扩增Ct值之间存在良好的线性关系,标准曲线为y=?3.508x+28.636,线性决定系数R2为0.997。在相对标准偏差≤25%的条件下,可准确检测猪DNA含量低至0.1%的DNA样品,猪肉含量低至5.0%的肉制品。通过对市售样品的检测,发现有的肉制品中掺有猪肉但未标识,有的配料表中猪肉并非主要成分但实际上猪肉占主要成分。本研究建立的实时荧光定量PCR能够准确可靠对肉制品中的猪肉成分进行检测,对准确鉴别肉制品掺假以及量化肉制品组分具有重要参考价值。     

基于LAMP法快速检测羊肉及其制品中的猪、鸭和羊源性成分

目的建立肉制品中猪、鸭和羊源性成分的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,对市售羊肉片、羊肉卷、羊肉串进行猪、鸭和羊源性成分检测分析。方法针对猪、鸭和羊线粒体Cytb基因分别设计2条外引物、2条内引物和2条环引物,优化LAMP反应条件,对猪、鸭和羊源性成分进行特异性和灵敏度试验,对羊肉制品进行上述动物源性成分监测。结果在0.2μmol/L外引物(F3和B3)、1.6μmol/L内引物(FIP和BIP)、0.8μmol/L环引物(FLP和BLP)、1 mol/L甜菜碱、6 mmol/L Mg SO4、1.6 mmol/L d NTP等参数的优化条件下,LAMP法对肉制品中猪、鸭和羊源性成分的检测灵敏度达0.5%。SYTO-9荧光染料的荧光实时检测结果与SYBR Green I染料肉眼观察结果一致。调查发现,该批市售羊肉及制品中存在掺假现象,掺假率为34.5%。结论 LAMP法具有操作简便、特异性强、灵敏度高、检测结果准确的特点,能有效地对肉制品中的猪、鸭和羊源性成分进行检测,可作为羊肉制品掺假的一种快速检测方法。     

鉴别绵羊肉中狐狸源性成分的环介导等温扩增检测方法的建立

目的建立一种能够快速区分出绵羊肉中掺入的狐狸源性成分的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。方法针对狐狸线粒体Cox I基因分别设计两条外引物和两条内引物,优化LAMP反应条件后并进行特异性和灵敏性试验,对绵羊肉中狐狸源性成分进行检测。结果在0.2μmol/L外引物(F3和B3)、1.6μmol/L内引物(FIP和BIP)、0.5 mol/L甜菜碱、0.4 mmol/L d NTP、4 mmol/L Mg SO_4等参数的优化条件下,可检测出掺假率为1.0%的羊肉制品,即最低检测浓度为2×10~(-4)ng/μl。结论本文所建立的LAMP法特异性强、灵敏度高,能有效地对绵羊肉中狐狸源性成分进行检测,可作为羊肉掺假的一种快速检测方法。     

荧光定量PCR方法检测肉制品中鳄鱼源性成分

针对鳄鱼色素细胞b基因序列设计特异性引物,建立一种快速、特异、灵敏的鳄鱼源性成分检测方法。以常见羊肉、牛肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鱼肉、虾肉为参考动物物种作特异性检测,并经检出限和灵敏度实验验证其可行性。结果表明：该方法能够有效对鳄鱼源性成分进行快速检测,具有较强的特异性,鳄鱼组分DNA的检出限可达0.001 ng/μL,灵敏度可达0.01 %。通过加工肉制品的检测验证,该方法拥有特异性强、灵敏度高的特点,可以用于加工肉制品中鳄鱼源性成分的检测。     

肉制品中猪肉源成分的Proofman-梯型熔解温度等温扩增检测

建立一种基于Proofman探针（proofreading enzyme-mediated probe cleavage）的梯型熔解温度等温扩增（ladder-shape melting temperature isothermal amplification,LMTIA）方法检测肉制品中的猪肉成分。选取猪细胞核中的特异性基因PRLR为靶基因,设计LMTIA引物和Proofman探针。通过优化反应体系,对所建立的方法进行特异性、灵敏度和最低检测限结果评价。结果表明：所建立的Proofman-LMTIA方法可在30 min内完成检测;相对于从鸡肉、鸭肉、牛肉、羊肉、猫肉、狗肉、玉米淀粉、红薯淀粉、木薯淀粉、绿豆淀粉、小麦粉中提取的基因组DNA,可特异性检测猪基因组DNA;检测灵敏度为1 ng/μL,对人工模拟的混合肉样中猪肉的最低检测限为0.1%。所建立的Proofman-LMTIA方法对猪肉成分有较好的特异性,能够快速、准确检测出肉制品中的猪肉成分,可对猪肉掺假进行快速检测。     

基于双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术的核酸杂交试纸条快速检测驴肉中的马源性成分

目的：建立快速、操作简单、价格相对低廉的驴肉中马源性成分快速可视化检测技术。方法：采用双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术(RPA)与核酸杂交试纸条相结合。针对马线粒体细胞色素b(cytb)基因设计RPA引物,引物包含3个功能区域,特异性绑定区域用于RPA扩增反应,spacer 9用于终止聚合酶的扩增,单链拖尾区域用于与试纸条上的探针杂交。这对特殊引物使RPA扩增子带有两个单链拖尾序列,这两个单链拖尾序列可以特异性地被金纳米探针和试纸条上的检测探针识别并捕获,形成一条肉眼可见的红色条带。整个扩增(15 min)和检测(5 min)过程在20 min即可完成,无需复杂的设备,仅需要一台数字化水浴锅。为进一步验证该方法的实际应用性能,对市面上的20份驴肉产品进行测定,并采用PCR(Polymerase Chain Reaction,PCR)结合琼脂糖凝胶电泳的方法进行验证。结果：该方法对马肉的检测限达到0.01%,且仅对马肉核酸有特异性扩增,与其他8个物种的核酸均无交叉反应,20份驴肉样品中有2份存在马源性成分。结论：该方法特异性强、灵敏度高,可实现驴肉中马源性成分的可视化快速检测。