牛奶过敏原β-乳球蛋白抗体的制备及免疫检测方法的建立

本文将牛奶过敏原β-乳球蛋白抗原分别免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠制备其多克隆抗体和单克隆抗体,并对所获得的抗体进行了效价等特性测定;采用蛋白A亲和层析法将多克隆抗体进行了纯化,采用辛酸-硫酸铵法对单抗细胞株3A7进行了纯化;实验建立了双抗体夹心的ELISA检测方法,并对一些蛋白样品进行了初步的检测。实验结果表明,所制备的抗β-乳球蛋白兔多克隆抗体效价达到了1:6.56×106;Western-blotting鉴定结果显示所制备的多克隆抗体能够与β-乳球蛋白特异性反应;3株单抗的效价均在106以上,纯化后多抗仅与酪蛋白有一定的交叉反应,而纯化后单抗与乳中主要蛋白及其它过敏原蛋白基本没有交叉反应,特异性很好;利用所建立的方法对一些蛋白样品进行检测,准确率100%。     

双抗体夹心ELISA法测定食物中大豆过敏原蛋白成分

通过建立双抗体夹心ELISA法测定食物中大豆过敏原蛋白成分,为进出口食品中大豆过敏原成分检测和食物过敏性疾病的预防提供技术基础.提取大豆总蛋白,免疫小鼠制备抗大豆总蛋白的多克隆抗体,用该抗体做包被抗体,并用生物素标记该多抗作为捕捉抗体,从而建立双多抗体夹心ELISA法;检测该方法的灵敏度,同时检测10种食品中是否含有大豆过敏原蛋白成分.SDS-PAGE电泳结果显示大豆过敏原总蛋白在120、60、35、30、28、18 ku处条带明显;免疫印迹显示,这些条带与制备的高效价抗大豆蛋白的多抗具有明显的阳性反应.检测食品中大豆过敏原蛋白成分双抗体夹心ELISA法最低检出限为～100 ng/mL,标准曲线在100ng/mL～12.8μg/mL范围内线性良好;10种进口食品检测结果与食物过敏原标签标注内容相符.     

双抗夹心酶联免疫吸附法检测荞麦过敏蛋白

提取制备荞麦过敏原蛋白(TBt)并免疫动物,分别制备鼠多克隆抗体和兔多克隆抗体,建立了双抗夹心酶联免疫吸附检测法(ELISA)用于检测食品中的荞麦过敏原。SDS-PAGE结果表明,纯化的TBt纯度达到98%以上,鼠抗血清效价为1∶6400。建立的双抗夹心ELISA法对荞麦过敏原蛋白的最低检测限为0.16μg/m L,线性范围为0.16~16μg/m L。并采用建立的双抗夹心ELISA法对市场出售的15种食品中荞麦过敏成分进行了检测。结果显示,该方法对绝大多数食品中的荞麦过敏原都有很好的特异性及灵敏性,说明该法可用于食物过敏原的诊断及食品中微量荞麦过敏成分的检测。     

双抗体夹心ELISA法测定食物中花生过敏原蛋白成分

通过建立双抗体夹心ELISA法测定食物中花生过敏原蛋白成分,为进出口食品花生过敏原成分检测和由花生导致的食物过敏性疾病的预防提供技术基础.提取花生总蛋白,免疫小鼠制备抗花生总蛋白的多克隆抗体,用该抗体包被酶标板,并用生物素标记该多抗,从而建立双多抗体夹心ELISA法;自制花生总蛋白标准品并检测该方法的灵敏度,同时检测15种食品中是否含有花生蛋白成分.成功地研制出双抗体夹心ELISA法检测食品中花生过敏原蛋白成分,具有特异性,其最低检出限为8ng/mL,标准曲线在8 ng/mL～125 ng/mL范围内线性良好;13种食品检测结果与食物过敏原标签标注内容相符,而2种标示不详的食品检测结果均呈现阳性.     

牛奶过敏原β-乳球蛋白的单克隆抗体制备及其双抗体夹心法的建立

目的制备与鉴定牛奶主要过敏原β-乳球蛋白(β-LG)的单克隆抗体,并建立双抗体夹心检测法。方法以β-LG为抗原免疫BALB/c小鼠,融合免疫鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤NS-1。半固体培养基法结合有限稀释法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,采用蛋白A亲和层析法获得纯化抗体。利用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型。间接ELISA方法和Western Blot鉴定抗体效价和特异性以及与其他过敏原的交叉反应性。建立双单克隆抗体夹心法,检测β-LG。结果共获得抗β-LG细胞株6株,分别命名为1H8,4A7,4C3,1F9,1G5,3D11,效价均高于20万。经抗体亚型鉴定,6株抗体均为Ig G1型。Western Blot的结果表明6株抗体能识别β-LG。在特异性检测实验中,6株抗体与其他种类食物过敏原无交叉反应,而1G5和3D11与牛奶酪蛋白过敏原有交叉反应性。通过建立双单克隆抗体夹心ELISA法,发现牛奶β-LG蛋白的检出低限为:15.625 ng/m L,标准曲线在15.625~250 ng/m L范围内线性良好。结论获得高效价抗体6株,建立了高效、高特异性的牛奶过敏原β-LG的检测方法,为食品中牛奶过敏原的检测提供了依据。     

黄曲霉毒素M_1酶联免疫吸附检测方法的建立

建立单抗-多抗夹心酶联免疫吸附(ELISA)检测方法,为黄曲霉毒素M_1(AFM_1)的快速检测及研究奠定基础。采用有机合成法将AFM_1转化成半抗原AFM1肟化物(AFM1O),进一步与载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)和卵清蛋白(OVA)偶联合成完全抗原AFM_1-KLH和AFM_1-OVA;以AFM_1-KLH为免疫抗原、AFM_1-OVA为筛选抗原,采用杂交瘤技术制备AFM1单克隆抗体,以AFM_1-KLH免疫新西兰大白兔制备兔多克隆抗体;以AFM_1-OVA为标准蛋白,制备的单克隆抗体为捕获抗体,纯化的兔多克隆抗体为检测抗体,商品化HRP标记的山羊抗兔Ig G作为检测二抗,采用方阵滴定法优化各步检测条件,得到最佳试验条件,建立AFM1夹心ELISA检测方法。标准曲线方程为y=0.004 4x+0.002 1(R2=0.992 2),检测范围0.5 ng/m L~128 ng/m L;最低检测限为0.5 ng/m L,批内和批间差均小于10%,重复性良好。     

双抗夹心酶联免疫吸附法检测沙门氏菌

沙门氏菌是自然界中普遍存在的一种食源性致病菌,在中国的食物中毒中沙门氏菌引起的病例占第一位。本研究以福尔马林灭活的鼠伤寒沙门氏菌免疫雌性日本大耳兔,制备抗沙门氏菌多克隆抗体。以抗沙门氏菌多克隆抗体作为捕获抗体,以抗沙门氏菌单克隆抗体C1359作为检测抗体,建立快速检测沙门氏菌双抗夹心ELISA方法。结果表明:该方法可以检测A、B、C、D、E等五种典型的沙门氏菌,对沙门氏菌纯培养液的最低检测量为1×104CFU/mL,与其他杂菌不存在交叉反应,具有较好的灵敏性和特异性。     

时间分辨免疫荧光法测定食物中花生过敏原成分

目的:建立双抗体夹心时间分辨荧光免疫法[Time-resolved Fluoroimmunoassay(TRFIA)]测定食物中花生过敏原蛋白成分,为进出口食品中花生过敏原成分检测和由花生导致的食物过敏性疾病的预防提供技术基础。方法:提取花生蛋白,免疫小鼠制备抗花生总蛋白的多克隆抗体,用该抗体包被酶标板,并用生物素标记该多抗作为捕捉抗体,Eu3+标记的链酶亲和素和以β-二酮体为主的增强液等试剂,建立双抗夹心TRFIA方法,检测该方法的灵敏度,同时用于13种食品中花生过敏原蛋白成分检测。结果:初步地研制出双抗体夹心TRFIA法检测食品中花生过敏原蛋白成分,具有特异性,和其最低检出限为0.1ng/mL,标准曲线在0.1～160ng/mL范围内线性良好;11种食品检测结果与食物过敏原标签标注内容相符,而2种标示不详的食品检测结果均呈现阳性。     

双抗夹心酶联免疫吸附快速检测冷鲜肉中的6 种血清型沙门氏菌

为快速检测冷鲜肉中的沙门氏菌,筛选出1 株产抗6 种沙门氏菌单克隆抗体的细胞株,运用产生的抗体建立酶联免疫吸附检测方法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）。实验采用6 种血清型致病沙门氏菌制备出混合抗原,对BALB/c小鼠及新西兰大白兔进行免疫,运用杂交瘤技术进行细胞融合,制备出抗沙门氏菌单克隆抗体以及多克隆抗体,并建立双抗夹心ELISA体系检测冷鲜肉中沙门氏菌。结果表明,成功筛选出1 株能稳定分泌抗沙门氏菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株6E7,保藏编号为CGMCC 10313以及多克隆抗体,效价分别为1∶1.28×106和1∶8.0×105 ;将多抗作为包被抗体吸附于96 孔酶标板上,并用辣根过氧化物酶标记单抗,建立双抗夹心ELISA体系;检测模拟污染肉样中沙门氏菌,其检测限为800 CFU/g;并与其他血清型沙门氏菌、志贺氏菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌及单增李斯特菌均无交叉反应,特异性良好。     

时间分辨免疫荧光法测定食物中鸡蛋过敏原蛋白成分

目的:建立双抗体夹心时间分辨免疫荧光法(TRFIA)用于测定食物中鸡蛋过敏原蛋白成分,为进出口食品鸡蛋过敏原成分检测提供技术基础.方法:提取鸡蛋过敏原总蛋白,免疫小鼠获得多克隆抗体,并以此抗体包被酶标板,采用生物素标记抗鸡蛋过敏原总蛋白抗体、Eu3+标记的链酶亲和素和以β-二酮体为主的增强液等试剂,建立双抗夹心TRFIA方法,用于检测10种食品中是否舍有鸡蛋蛋白成分.结果:鸡蛋总蛋白SDS-PAGE显示带大致有10条,其中主要条带有4条,分子量分别为71、55、38、14kDa;成功地研制出双抗体夹心TRFIA法检测食品中鸡蛋过敏原蛋白成分,具有特异性,其最低检出限为0.625ng/mL,标准曲线在12.5～640ng/mL范围内线性良好;8种食品检测结果与食物过敏原标签标注内容相符,而2种标示不详的食品检测结果均呈现阳性.结论:初步建立了检测食品中鸡蛋过敏原蛋白成分的双抗体夹心TRFIA,具有较好的特异性和灵敏度;该方法对于未标注鸡蛋过敏原成分的食品检测具有一定的实际应用价值.     

地西泮单克隆抗体的制备及其酶联 免疫吸附检测方法的建立

目的 制备地西泮(Diazepam DZP)单克隆抗体,并且对制备的抗体进行一系列性质鉴定。方法 利用EDC法合成免疫原和包被原,用免疫原免疫Balb/C小鼠,当效价到1:16000以后取小鼠脾脏与SP2/0进行细胞融合。然后采用竞争结合双阳性两步筛选法,筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞,并且利用有限稀释亚克隆方法得到单株细胞,采用体内诱生法制备腹水型单克隆抗体。接着利用辛酸-饱和硫酸铵法对腹水型抗体进行纯化,利用酶联免疫吸附,SPR等方法对纯化后的抗体进行性质鉴定。结果 成功合成了地西泮免疫原和包被原,免疫Balb/C小鼠7次后效价达到1:16000,最终制备出单克隆抗体,抗体解离常数(KDs)为4.0985×10_-7M,且与大部分结构类似物没有明显的交叉反应。应用此抗体建立间接竞争ELISA法,抗体的IC₅₀=10.8ng/mL,检测范围为0.45ng/mL-862ng/mL。结论 制备出了地西泮单克隆抗体,为地西泮的免疫学检测提供了有力的支持。     

酚酞单克隆抗体的制备

目的 建立免疫学快速检测减肥类保健食品中非法添加的酚酞, 制备酚酞单克隆抗体并进行评价。方法 利用碳二亚胺(carbodiimide, EDC)法合成免疫原和包被原, 用免疫原免疫Balb/C小鼠, 取小鼠脾脏与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合。采用竞争结合双阳性两步筛选法, 筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞, 利用有限稀释亚克隆方法得到单株细胞; 采用体内诱生法制备腹水型单克隆抗体。利用辛酸-饱和硫酸铵法对腹水型抗体进行纯化, 利用酶联免疫吸附法鉴定纯化后的抗体。结果 成功合成了酚酞-BSA免疫原和酚酞-OVA包被原, 筛选获得酚酞杂交瘤细胞株FT/BSA/2019, 单克隆抗体的效价1×105。结论 本研究初步建立了特异性高的酚酞单克隆抗体的制备方法。     

米酵菌酸单克隆抗体的制备与鉴定

目的 建立鲜湿米粉中米酵菌酸(bongkrekicacid,BA)的免疫学快速检测方法,制备特异性识别BA的单克隆抗体并进行评价。方法 利用碳二亚胺[1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC]法将BA半抗原与牛血清白蛋白(bovineserumalbumin, BSA)和卵清蛋白(ovalbumin, OVA)载体偶联,分别合成BA免疫原(BA-BSA)和包被原(BA-OVA),用BA-BSA免疫Balb/C小鼠,取免疫效果好的小鼠脾脏与小鼠NS-1骨髓瘤细胞进行融合。采用间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay, icELISA)进行筛选,筛选出能分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞,利用有限稀释法进行亚克隆得到单株能稳定分泌所需抗体的细胞;采用体内诱生法制备腹水型单克隆抗体。利用正辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水型抗体,通过酶联免疫吸附法测定纯化后的抗体效价。结果 成功合成了BA免疫原BA-BSA和BA包被原BA-OV...     

2,4-二氯苯氧乙酸人工抗原合成及鼠源多克隆抗血清的制备

采用碳化二亚胺法(EDC法)将2,4-D与牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联,合成免疫原2,4-D-BSA和包被原2,4-D-OVA,采用紫外扫描(UV)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法进行鉴定;用2,4-D人工免疫抗原(2,4-D-BSA)免疫BALB/c纯系小鼠,采用间接ELISA测定多抗血清效价、阻断ELISA鉴定其抑制。结果表明:BSA与2,4-D偶联后,波峰出现右移,表明偶联成功;SDS-PAGE电泳中BSA的泳动速度大于2,4-D-BSA,表明2,4-D已与BSA成功偶联;6只小鼠血清效价均达到了1:1.28×104,且1号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制IC50为72.48ng/mL,表明成功获得了高效价、特异性好、亲和力较高的鼠源抗2,4-D多克隆抗体血清,为2,4-D残留免疫学检测方法的建立奠定了良好的基础。     

Use of sandwich IgG ELISA for the detection and quantification of adulteration of milk and soft cheese

The aim of this work was to develop an assay capable of detecting adulteration of soft goat, sheep and buffalo milk cheese with bovine milk from cheaper sources. A previously developed indirect competitive ELISA had a lower sensitivity when applied to cheese, compared with milk. A sandwich ELISA was developed utilising the same monoclonal antibody in combination with a polyclonal goat anti-bovine IgG antibody. Once optimised, the ELISA was found to be highly specific. Detection limits in milk were 0.001% cows’ milk adulteration of sheep or buffalo milk, and 0.01% cows’ milk adulteration of goat milk. Detection limits in soft cheese were 0.001% in goat cheese and 0.01% in sheep or buffalo cheese. The assay was highly reproducible with both intra- and inter-assay coefficient of variation <10%. The ELISA performance makes it suitable for development as a kit for use in routine surveillance of milk and soft cheese.     

牛初乳中免疫球蛋白G双抗夹心ELISA检测方法的建立

将牛免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、筛选获得分泌抗牛IgG单克隆抗体的细胞株。制备小鼠腹水抗体,进一步纯化获得抗牛IgG单克隆抗体。建立双抗夹心酶联免疫吸附法检测牛初乳中IgG质量浓度,该方法在7.8～1 000 ng/mL范围内有良好的线性关系,最低检出限为7.06 ng/mL,批内变异系数为4.52%,批间变异系数为4.94%,回收率为91.85%～102.45%。此法操作简便、准确度高、稳定性好,可用于实际牛初乳样品的快速检测。     

三聚氰胺单克隆抗体制备与鉴定

目的制备高度特异的三聚氰胺单克隆抗体,经酶联免疫吸附试验鉴定并制备胶体金试剂盒。方法以牛血清白蛋白交联的三聚氰胺为抗原,免疫BALB/c小鼠,通过传统杂交瘤融合和筛选技术制备抗三聚氰胺单克隆抗体,经纯化制备腹水,采用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immune sorbent assay, ELISA)对抗体进行效价测定、亚类测定、交叉鉴定和蛋白质免疫印迹试验(westernblot)特异性鉴定后制备胶体金试剂盒。结果筛选出1株抗三聚氰胺单抗,制备的三聚氰胺胶体金试剂盒敏感值能达到30μg/L。结论获得了高度特异的且能稳定分泌三聚氰胺抗体的细胞株。     

双抗夹心ELISA方法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

采用0.5% 福尔马林灭活的单核细胞增生李斯特氏菌作为免疫原免疫日本大耳兔,获得抗单核细胞增生李斯特氏菌多克隆抗体,并以此多克隆抗体作为捕获抗体,以抗单核细胞增生李斯特氏菌Internalin A(InlA)单克隆抗体作为检测抗体,建立快速、特异的检测该菌的双抗夹心ELISA 方法。结果表明：该方法对单核细胞增生李斯特氏菌纯培养液的最低检测量为1.7 × 105CFU/mL。在检测食品样品的实验中,食品样本对本方法干扰较小,运用选择性增菌液进行前增菌可提高该方法的准确性。     

抗副溶血弧菌OMPK单克隆抗体的制备及其ELISA双抗体夹心检测方法建立

制备全长和截短的弧菌外膜蛋白K（outer membrane protein K,OMPK）,纯化后的OMPK免疫6～8 周雌性BALB/c小鼠,间接夹心酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测小鼠的血清效价,结果表明全长OMPK重组蛋白制备的血清效价是截短OMPK1重组蛋白制备血清效价的128 倍。通过全长的OMPK重组蛋白制备多株用于检测副溶血弧菌的单克隆抗体,用生物素（biotin）和辣根过氧化物酶对单克隆抗体进行标记。间接夹心ELISA实验结果表明：只有VP3-biotin和VP16-biotin与其他单克隆抗体配对检测不同的副溶血弧菌菌株表现出较高的灵敏度及良好的特异性,并且在检测其他种属20 株菌时无交叉反应。VP16(Fab)-biotin/VP3检测副溶血弧菌时较VP16-biotin/VP3具有更高的灵敏度,该方法用于检测海鲜样品时,VP16-biotin/VP3检测三文鱼（5～10 CFU/25 g）和血蚶样品为副溶血弧菌阳性。本研究开发了一种快速、灵敏、简便的副溶血弧菌间接夹心ELISA检测方法。