白酒窖泥微生物多样性研究方法及进展

浓香型白酒通常采用固态发酵法,使用泥窖发酵,因此在发酵过程中窖泥中部分微生物进入到白酒糟醅中,在白酒的香型形成中发挥着重要的作用,对窖泥微生物多样性的解析就显得极为重要。由于传统的微生物群落分析方法依赖于纯培养技术,对于多数营养要求苛刻、严格厌氧的微生物分离较为困难,难以获取窖泥中微生物群落多样性更为完整全面的信息。概述常用的传统纯培养方法及克隆文库、磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid,PLFA)、变形梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、第二代测序技术、宏基因组技术等不依赖于纯培养技术的窖泥微生物多样性研究的技术方法,并简要介绍了将来可能在窖泥微生物研究中得到广泛应用的三代测序技术。     

浓香型白酒酿造用窖泥微生物群落研究

<正>浓香型白酒窖泥中栖息着大量可培养及不可培养的微生物,而这些微生物群落组成及多样性反映了窖泥质量,并在很大程度上决定了浓香型白酒品质。全面剖析窖泥中功能微生物菌群组成及多样性、窖泥质量与微生物群落之间的关联性为深入认识浓香型白酒生产机制,从根本上提升浓香型白酒品质提供理     

浓香型白酒窖泥微生物群落研究进展

窖泥微生物是决定浓香型白酒风格的关键因素。多种分子生物学新技术（如以聚合酶链式反应（PCR）为基础的技术、基因组学技术、高通量测序技术等）已用于窖泥微生物群落结构及功能研究,检测到越来越多的窖泥微生物,发现微生物多样性越来越高。老窖泥中的标志性优势微生物,在门水平为厚壁菌门（Firmicutes）、广古菌门（Euryarchaeota）、拟杆菌门（Bacteroidetes）,在纲水平为梭菌纲（Clostridia）,在属水平为梭菌属（Clostridium）、沉积微生物属（Sedimentibacter）、甲烷杆菌属（Methanobacterium）等。氢营养型甲烷菌既可以促进窖泥的老熟,又对浓香型白酒的香味物质的生成也有重要作用。有些环境因子对窖泥微生物有明显影响,且与有益微生物呈正相关。     

浓香型大曲白酒窖泥微生物研究进展

基于传统微生物技术和现代生物学技术对白酒窖泥微生物的研究,阐述了研究白酒酿造微生物所运用生物学技术的各种方法、原理及对窖泥微生物的研究现状。主要对宏基因组、聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术、高通量测序技术等现代分子生物技术在窖泥微生物代谢活动和群落代谢机制研究中的应用进行了综述,为解决白酒生产中遇到的实际问题提供了理论指导。     

基于PCR-DGGE技术分析浓香白酒窖泥梭菌多样性

窖泥是浓香型白酒酿制过程中最主要的微生物源,窖泥中微生物的类型、丰度、新陈代谢活动等均对浓香型白酒品质产生很大的影响。为探究窖泥中梭菌微生物的多样性,利用窖泥理化结合聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术对10个窖泥样品中的梭菌群落及变化规律进行研究。结果表明,所选10个窖泥的理化参数均符合优质窖泥指标要求;在微生物层面,窖泥中检测到的梭菌在属水平上有：嗜碱菌属、丁酸弧菌属、梭菌属、喜热菌属、瘤胃梭菌属、粪球菌属、沉淀杆菌属（Sedimentibacter）、钙原杆菌属（Caldicoprobacter）、温带菌（Tepidimicrobium）、梯氏菌（Tissierella）、孢子菌（Sporanaerobacter）、硫酸盐还原菌属、鲁替孢菌属和梭状芽胞杆菌（Clostridiisalibacter）等,这些菌是优质窖泥的重要指示菌,可知窖泥中含有极其丰富的酿酒功能菌。揭示了可能在白酒酿造中起关键作用的梭菌菌群,在分子水平上为研究浓香型白酒提供了理论依据。     

宜宾产区浓香型白酒酿造生境中细菌的群落结构

该文利用高通量测序技术全面解析宜宾产区浓香型白酒酿造生境中的微生物菌群结构,并对窖泥、大曲、酒醅和黄水中的细菌种类和丰度进行对比分析。结果表明,从宜宾产区白酒酿造生境的26个样品中共注释到来自于201个属的1493个OTUs,主要分布于拟杆菌门(Bacteroidete)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes),其中5个属来自于古菌域的广古菌门(Euryarchaeota)。窖泥样品中微生物菌种的多样性最高,主要以古菌、瘤胃球菌和乳酸菌为主;大曲的多样性次之,主要包括未鉴定到属水平的细菌,芽胞杆菌、乳酸菌和高温放线菌等;酒醅和黄水中的微生物多样性最低,其主要微生物类群以乳酸菌和瘤胃球菌为主。宜宾产区浓香型白酒酿造过程微生物群落结构呈现出从多种微生物共同作用到功能微生物主要发挥作用的趋势。该研究为探究浓香型白酒酿造过程中功能微生物,解析白酒酿造机理,提升白酒品质奠定了基础。     

退化和正常窖泥微生物多样性的比较分析

浓香型白酒窖泥微生物多样性反映了窖泥质量,并在很大程度上决定了浓香型白酒品质。本研究采用Miseq高通量测序技术对退化窖泥(n=5)和正常窖泥样品(n=5)细菌多样性进行了比较分析,结果发现退化窖泥微生物群落的超1和香农指数均显著高于正常窖泥(p<0.05)。退化窖泥中Clostridium(梭菌)、Syntrophaceticus、Syntrophomonas(互营单胞菌属)、Petrimonas、Sedimentibacter(沉淀杆菌属)、Aminobacterium(胺小杆菌属)、Lysinibacillus(梭形杆菌属)和Pelotomaculum的相对含量显著高于正常窖泥(p<0.05),而Lactobacillus(乳酸杆菌)、Bacillus(芽孢杆菌)、Ralstonia(雷尔氏菌属)和Nocardia(诺卡氏菌属)呈现出相反的趋势(p<0.05)。基于UniFrac距离的主坐标分析和聚类分析均表明,2类窖泥细菌群落结构存在较大差异。通过冗余分析发现9个OTU代表了2类窖泥微生物群落结构差异显著相关的关键细菌类群,其中4个隶属于Lactobacillus(乳酸杆菌)的OTU在正常窖泥中含量比较高,5个分别隶属于Clostridium(梭菌)、Syntrophomonas(互营单胞菌属)、Pelotomaculum和Synergistaceae(互养菌科)的OTU在退化窖泥中含量比较高。本研究对揭示细菌多样性和窖泥质量间的关联性可能具有一定积极意义。     

基于磷脂脂肪酸剖析不同老熟方法的窖泥微生物群落结构

针对白酒发酵过程中窖泥微生物群落结构的特殊性,采用磷脂脂肪酸（PLFA）指纹图谱法对不同老熟方法制备的窖泥的微生物群落特征进行研究。结果表明,使用方法C制得的窖泥经三轮次酿酒生产后,其中的微生物多样性较方法A与方法B丰富,且特征PLFA的种类与50年以上窖龄窖池窖泥相同;使用方法C制得的窖泥微生物含量高于方法A与方法B,并接近于50年以上窖龄窖池窖泥;使用方法C制得的窖泥微生物群落结构特征与50年以上窖龄窖池的相似度最高。使用方法C的窖池所生产的浓香型白酒出酒率最高,为（36.52±0.67）%,窖香浓郁、酒体丰满、入口醇甜、味长、尾净。因此,使用方法C所制得的窖泥优于方法A与方法B。     

泸州老窖窖泥中重要功能菌群分布及代谢产物研究

通过对泸州老窖酒厂不同窖龄窖泥中五大功能菌群的数量分布、生态结构的研究,发现甲烷菌、己酸菌、丁酸菌的数量随窖龄而增加。同时,窖泥中酸类和酯类微量化学成分含量和种类随功能菌数量同步增加。在传统工艺的长期影响下,在窖泥发酵方面形成了一个相对稳定的化学生态环境和固有的微生物区系生态结构,它们是生产优质浓香型白酒的基础。本研究进一步揭示了窖泥功能菌的生理特征和特殊功能,为多菌种混合发酵培养人工窖泥母液提供技术指导,以此培养出优质窖泥,提高浓香型白酒的质量和产量。     

不同窖龄及位置浓香型白酒窖泥中细菌群落结构的差异性分析

采用高通量测序技术对金徽酒不同窖龄及窖池位置的窖泥细菌群落进行研究,通过聚类分析探寻细菌菌群的时空分布特点,并对窖泥微生物的功能基因进行注释分析。结果表明,14个窖泥样品中,厚壁菌(Firmicutes)是细菌群落的绝对优势菌门,平均相对丰度达73.39%。乳杆菌(Lactobacillus)是5年和7年窖龄窖泥(84.48%)的第一优势菌属。随着窖龄的增加,优势菌属由单一Lactobacillus占优势演变为己酸菌(Caproiciproducens,4.61%)、拟杆菌(Bacteroides,3.16%)等11个细菌属共存的复杂微生态环境。窖泥细菌菌群多样性与窖龄呈显著正相关(P<0.01),且池底窖泥的细菌菌群多样性高于池壁泥。30年和50年窖龄的窖泥细菌群落相似性较高,且细菌菌群之间大多呈正相关关系。同现网络中共出现9个枢纽,各枢纽均与Lactobacillus呈负相关关系。KEGG功能注释图说明影响白酒产量和质量的主要功能基因在窖泥主体特征代谢分类上。该研究为解析甘肃金徽酒窖泥中的细菌群落结构及其时空分布规律奠定了基础。     

生香酵母在液体窖泥中的应用

在浓香型白酒生产中,窖泥中己酸菌数量的多少及其质量的优劣直接影响酒质。研究生香酵母与己酸菌复合培养制作的复合液体窖泥应用于浓香窖池养护,试验结果表明,生香酵母与己酸菌的复合培养,可进一步提高液体窖泥中己酸菌数量及代谢产物,有利于浓香型白酒生产中窖池的养护效果,对提高浓香型白酒的产量和优质酒率有促进作用。     

北方护窖液人工养窖方法的应用与研究

北方浓香型白酒厂,由于地理环境的因素,昼夜温差大,气候干燥,蒸发量大,加上土质的原因,窖泥更容易退化和板结,因此,窖泥的维护、保养环节就成了生产优质浓香白酒的重中之重。护窖液,就是专门针对北方浓香酒厂窖泥退化而制作的生物活性培养发酵液,是为了增加窖泥中的功能菌数量和生物活性、补充窖泥中微生物生长所缺乏的营养物质和水分,而有针对性的配制和培养的生物营养液,也叫功能菌发酵液。     

金种子优质窖泥高产己酸菌的筛选鉴定及其应用性能分析

在浓香型白酒酿造过程中,窖泥作为酿酒微生物的重要载体对曲酒的酒体质量与风格特征具有重要影响。从优质窖泥中筛选高产己酸菌,并制备人工窖泥以提高酒体中己酸乙酯的含量或制备生产己酸乙酯产品等,对曲酒生产具有重要意义。本文通过富集培养、平板涂布、发酵液己酸含量检测、16S rDNA分析等方法,筛选鉴定高产己酸菌株,并考察培养温度、乙醇浓度、pH值等发酵条件,分析己酸菌液配方组分单因素含量影响等。结果表明,筛选得到的高产己酸菌JZZ,其液态发酵己酸平均产量为4.36 mg/mL,温度耐受区间为36~39℃,乙醇耐受浓度为2%~6%,己酸菌液配方组分添加量为硫酸镁0.01%,硫酸铵0.05%,磷酸氢二钾0.3%,乙醇2%,16S r DNA比对结果表明,JZZ菌株为克氏梭状杆菌(Clostridium kluyveri)。     

复合窖泥功能菌液的制作及在浓香型白酒生产中的应用

以优质窖泥为基础,生产复合窖泥功能菌液,应用于浓香型白酒生产的粮醅发酵中。结果显示,浓香型白酒发酵中添加复合窖泥功能菌液可升高发酵温度,提高原料的利用率,同时己酸乙酯的生成量高于对照组40%;在“增己降乳”方面,发挥作用显著,且对浓香型白酒的口感有较好的改善。     

浓香型白酒地域性及窖泥微生物研究进展

为了筛选优良果蔬发酵用益生菌,从益生菌剂及土法发酵的酵素液体中分离并鉴定了9株益生菌,并对其耐酸、耐胆盐能力进行分析。经初筛选出4株性能优良的益生菌株,并对它们进行了产酶、产酸、自由基清除等益生特性的研究。结果表明：9株益生菌均具有一定的耐酸耐胆盐能力,其中菌株B1的耐酸能力最强,在pH为1.0条件下的存活率为（93.69±2.25）%;菌株B8的耐胆盐能力最强,在胆盐浓度1.5%的条件下的存活率为（81.74±1.52）%。综合耐酸耐胆盐能力及益生性能,最终获得了具有产淀粉酶、DPPH自由基清除（91.46%）及产酸（13.14 g/L）能力的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）B6,可作为优良菌株进行研究与开发。     

新老五甑两种工艺比对研究

通过对老五甑和新五甑两种工艺试验比对,开展两种工艺窖池酒体产量、理化、感官及窖泥变化分析,发现新五甑比老五甑出酒率高约4.4%,总己酸乙酯高约27.2%,总酯高约28.8%,总酸低约13.3%,酒体窖香更浓郁,窖泥中梭状芽孢杆菌数量更优。该研究结果为浓香型白酒不同排次工艺调整提供了理论依据和参考。     

浓香型白酒酿造中大曲量化使用模型的研究与应用

在浓香型白酒酿造生产中,大曲药用量直接影响酿酒的产质产量。通过对酿酒生产过程中气温变化、生产轮次、配糟比例、入窖温度、入窖酸度、入窖淀粉浓度等因素进行分析,开展曲药使用与生产因素的量化关系研究,建立大曲量化使用模型,实现曲药使用提前预判→量化计算→准确计量→结果验证的科学生产方式,为今后智能化酿酒生产提供参考。