Mass Preparation and Regeneration Conditions of Protoplast from AspergiUus oryzae AS 3. 951 and RIB40

针对2株米曲霉进行原生质体制备条件的研究,比较了制备材料、菌龄、渗透压稳定剂、复合酶配比、酶解时间以及酶解温度对米曲霉原生质体形成和再生的影响。结果表明,2株米曲霉原生质体制备的最适宜条件稍有差异,其中米曲霉3.951菌株原生质体制备和再生的适宜条件是：以菌丝为制备材料,菌龄为14 h,渗透压稳定剂为0.8 mol/L NaCl,复合酶配比为1.0%纤维素酶、1.0%裂解酶、0.l%蜗牛酶,酶解时间为3 h,酶解温度为35℃;米曲霉RIB40的适宜条件是：以菌丝制备材料,菌龄为12 h,渗透要稳定剂为0.8 mol/L NaCl,复合酶配比是为1.0%纤维素酶、1.0%裂解酶、0.l%蜗牛酶,酶解时间为3 h,酶解温度是35℃。在优化条件下米曲霉3.951菌株释放的原生质体达6.43×107个/g,再生率可达23.5%,米曲霉RIB40释放的原生质体可达4.24×107个/g,再生率达22.41%。     

长枝木霉原生质体制备及再生条件研究

研究优化了长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）JK-15菌株菌丝体制备原生质体细胞及再生的条件。通过单因素试验和正交试验对影响原生质体形成和再生的菌龄、破壁酶组成、酶解反应温度及时间、渗透压稳定剂等因素进行了筛选优化。结果表明,长枝木霉菌株JK-15的最适条件为菌丝体菌龄18 h,混合酶组成配比为1.5%蜗牛酶∶1.5%纤维素酶∶0.1%溶壁酶,酶解条件为30 ℃条件下酶解2.5 h,原生质体制备过程中渗透压稳定剂为0.7 mol/L山梨醇,原生质体再生培养基中渗透压稳定剂为0.7 mol/L蔗糖,实验结果为长枝木霉JK-15的育种工作奠定了良好的技术基础。     

产辅酶Q10的米曲霉原生质体制备条件研究

为了提高辅酶Q10的产生菌米曲霉菌的基因组改组育种效率,以提高辅酶Q10的产量,本试验对米曲霉原生质体的制备条件进行了研究。通过对影响制备效果的条件,即米曲霉的菌丝菌龄、酶解温度、时间和原生质体稳定剂的浓度四个因素进行全面优化,并利用正交试验确定了原生质体制备的适宜条件:菌龄为12h、原生质体渗透压稳定剂NaCl浓度为0.85mol/L、酶解时间为3.5min、酶解温度为30℃时,米曲霉原生质体制备效果最好,所得原生质体为6.3×106个/mL,再生率达到38.06%。较高的原生质体生成量和再生率为该菌后序的基因组改组研究奠定了基础。     

康氏木霉原生质体制备及再生条件研究

研究纤维素酶高产菌株康氏木霉原生质体制备及再生的适宜条件,为该菌细胞融合和诱变育种提供适宜的真菌状态。对影响原生质体形成和再生的各因素(菌龄、蜗牛酶浓度、酶解温度和时间、渗透压稳定剂的成分和浓度)进行试验比较。康氏木霉原生质体制备的最佳条件:菌龄22h,蜗牛酶浓度2.0%,酶解温度30℃,酶解时间2.5h,蜗牛酶溶液中的渗透压稳定剂为0.6mol/L NaCl,再生培养基中的渗透压稳定剂为0.8 mol/L蔗糖。可以获得细胞融合和细胞突变诱导所需的原生质体数量。并观察到原生质体的释放方式主要有2种:顶端释放和段端位释放;以一种方式进行再生。     

酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母原生质体制备与再生研究

研究了菌龄、酶浓度、渗透压稳定剂及酶解时间等因素对酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)和马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)原生质体形成与再生的影响。实验结果表明,原生质体形成与再生的最佳条件为酿酒酵母菌龄9h,采用1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶,30℃酶解70min;马克斯克鲁维酵母菌龄8h,采用1.0%蜗牛酶+0.5%纤维素酶,30℃酶解时间50min;配制酶液时渗透压稳定剂采用4%氯化钠高渗缓冲液,在稀释和配制再生培养基时则采用15%的蔗糖高渗缓冲液。     

桦褐孔菌原生质体制备与再生

研究桦褐孔菌原生质体制备与再生条件。采用正交试验法确定复合酶比例,用单因素试验测定不同等渗液、酶解时间、桦褐孔菌菌龄、酶解温度、再生培养基对桦褐孔菌原生质体制备与再生的影响。结果表明：混合酶(纤维素酶5mg/mL、蜗牛酶15mg/mL、溶壁酶15mg/mL、崩溃酶15mg/mL)、菌龄为7d的菌丝,采用0.6mol/L MgSO4为渗透压稳定液,酶解温度35℃,酶解时间5.5h,有利于原生质体的制备。就原生质体再生而言,酶解时间为3.5h制得的原生质体,以MgSO4作为渗透压稳定液,以完全再生培养基(CYM)和麦芽酵母葡萄糖再生培养基(GYM)有利于原生质体再生,再生率最高为0.13%。     

米曲霉沪酿3.042原生质体制备和再生的研究

研究了酶液组成、酶解温度、酶解时间、渗透压稳定剂、培养基成分、再生培养方式等因素对米曲霉沪酿3.042原生质体制备和再生的影响,建立了米曲霉沪酿3.042原生质体制备和再生的适宜方法,即在查氏液体培养基中28℃培养10h,菌体用0.8mol/L NaCl配制的3%溶壁酶、1%纤维素酶、1%蜗牛酶、0.5%溶菌酶的复合酶液,30℃酶解4h￣6h后,经0.8mol/L NaCl再生固体培养基,双层平板培养法进行原生质体再生,可获得超过70%的再生率。为进一步通过原生质体技术选育优良的酱制品生产用菌株奠定了方法学基础。     

氯化锂诱变黑曲霉原生质体选育高产植酸酶菌株

采用氯化锂诱变黑曲霉原生质体,筛选高产植酸酶菌株。获得制备黑曲霉原生质体的最适条件:纤维素酶1.0%,蜗牛酶0.5%,菌龄24 h,酶解温度30℃,酶解时间2 h,渗透压稳定剂0.7 mol/L NaCl。采用氯化锂对制得的原生质体进行诱变,结果表明:经0.15%LiCl诱变后,原生质体存活率为23.37%,此时,获得一株植酸酶活最高的突变株,为19.24 U/mL,比出发菌株提高54.41%,该菌株具有良好的遗传稳定性。     

利用原生质体再生技术选育内切型菊粉酶高产菌株

利用原生质体制备与再生技术选育内切型菊粉酶高产菌株,以I200913作为出发菌株(酶活为0.413 u/m L),研究了在不同酶配比酶解液、不同酶解温度、不同酶解时间的条件下,对原生质体制备、再生以及内切型菊粉酶酶活的影响。研究结果表明,在酶配比为:纤维素酶0.7%+蜗牛酶0.2%+溶菌酶0.1%=1%,酶解温度为30℃,酶解时间为2.5h条件下,原生质体形成率最高,为22.32%。在酶配比为:纤维素酶0.7%+蜗牛酶0.2%+溶菌酶0.1%=1%,酶解温度为30℃,酶解时间为2.5h条件下,原生质体再生率最高,为16.02%。在酶配比为:纤维素酶0.7%+蜗牛酶0.2%+溶菌酶0.1%=1%,酶解温度为30℃,酶解时间为2.5h条件下,原生质体再生菌株内切型菊粉酶酶活最高为0.598 u/m L,比出发菌株提高了28%。     

双亲灭活米曲霉原生质体融合中原生质体制备的研究

对双亲灭活米曲霉原生质体融合育种中原生质体制备的条件进行了研究,将菌丝的预处理与细胞壁的酶解合为一步,并讨论了DTT的加入量。结果表明,原生质体制备的最佳破壁酶为纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶3种酶混合浓度比为5:3:1;菌丝培养15h;酶解时加入3mol/L DTT;酶解2.5h;0.8mol/L NaCl作为渗压稳定剂。所得双亲菌株原生质体的融合率为3.31%。     

高产L-乳酸米根霉的原生质体制备与再生条件研究

为建立原生质体融合法选育高产L-乳酸米根霉(Rhizopus oryzae)菌株,对米根霉菌株原生质体制备及再生条件进行研究。考察酶种类、酶质量浓度、时间、温度、pH值、渗透压、预处理等因素对原生质体制得量及再生率的影响,获得原生质体制备及其再生的优良条件：不添加甘氨酸,渗透压稳定剂为0.6mol/L的NaCl缓冲液,按1.5mg/mL组合酶质量浓度,蜗牛酶、纤维素酶和溶壁酶质量浓度配比为1:1:1进行混合,35℃、pH6、酶解2h,可获得原生质体制得量最大为2.74×106个/mL,再生率最高为6.8%。     

影响米曲霉QU3601原生质体形成的因素

研究了酶系统、酶解温度、酶解时间、渗透压稳定剂、培养基等因素对米曲霉QU3601原生质体形成的影响，获得了制各米曲霉QU3601．原生质体的最适条件，为原生质体技术改良QU3601。的生产性能奠定了方法学基础，并为相关霉菌原生质体的制各提供借鉴。     

灵芝原生质体诱变选育高产漆酶突变株的研究

对一株产漆酶活性较高的灵芝(Ganoderma.lucidumKarstNo.1)原生质体的制备、再生及紫外诱变育种进行了研究,获得了1株漆酶活性比对照菌株提高2.83倍的突变株G301。实验所确定的原生质体最佳制备条件为:以蔗糖为稳渗剂,采用4%(W/V)溶壁酶与2%(W/V)蜗牛酶等体积混合酶液,在30℃、pH6.0下,对液体培养48h的灵芝菌丝体酶解1h;同时实验所确定的原生质体诱变的适宜条件为:30W紫外灯距离40cm照射30s。     

微波-紫外灭活原生质体融合选育米曲霉菌株的研究

实验对生长速度较快但产酶能力较低的米曲霉CICC2339的原生质体采用700W微波灭活12s,对产酶能力较高但生长速度较慢的米曲霉AS3.951的原生质体采用15W紫外灭活5min,然后对灭活双亲用PEG作融合剂进行原生质体融合,融合率达到了7.6%。通过测定Hc值以及蛋白酶活力大小,最终筛选出编号为CAW202、CAW205和CAW210的三株融合株,其生长速度快且蛋白酶活力还高于产酶能力较高的亲本菌株CICC2339;三株融合株的蛋白酶活力分别为10450U/g、9730U/g、10780U/g,其中融合株CAW202和CAW210的蛋白酶活力比亲本菌株CICC2339有了显著的增加,分别提高了7.8%和11.25%。     

红曲霉M9x的原生质体形成与再生条件的研究

对红曲霉M9x用混合酶制取原生质体及原生质体再生条件进行了探索。其原生质形成和再生最佳条件为:以豆芽汁培养液为菌丝培养基,采用60h菌龄的菌丝体,以0.6mol/LMgSO4作为渗稳剂,用1.5%混合酶(蜗牛酶:纤维素酶=7:3)在30℃处理2h,原生质体形成数可以达到1.61×107个/ml,再生率为8.49%。     

啤酒酵母原生质体制备与再生条件的筛选

试验正交设计方法,对啤酒酵母原生质体制备与再生进行了研究。试验表明:以静置培养12h的细胞,0.6mol/L KCl作为渗透压稳定剂,经EDTA-Na2+预处理,在2%蜗牛酶作用下,32℃酶解90min为条件获得最佳制备率,制备率为99%以上;以静置培养14h的细胞,0.6mol/L蔗糖作为渗透压稳定剂,不经过预处理,在1.5%蜗牛酶作用下,30℃酶解120min,涂布于山梨醇为渗稳剂的再生培养基中为条件获得最佳再生率,再生率为65%。     

酱油曲霉孢子原生质体的制备与紫外诱变育种

由1株分离、纯化自曲精的酱油曲霉的分生孢子制备原生质体,并进行紫外诱变,得到7株中性蛋白酶活提高幅度较大的紫外突变株U系,中性蛋白酶活最高的1株达到6 197.4U,为出发株的1.94倍。对原生质体制备条件进行了优化:选取孢子生长旺盛的新鲜斜面培养物(培养5 d左右)制备孢子悬浮液;采用25 mmol/L-巯基乙醇+5 mmol/L Na2EDTA体系预处理20 min;酶解条件是:1%溶菌酶+1%蜗牛酶+1%纤维素酶,山梨醇作为渗透压稳定剂(0.6 mol/L,pH6.88),酶解温度33℃,酶解5 h;再生培养基为0.6 mol/L NaCl高渗透压豆汁培养基,涂布法再生。