食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因型分布研究

目的 采用PCR法扩增食源性金黄色葡萄球菌中肠毒素基因以了解该菌肠毒素基因携带情况,比较食物中毒和食品监测来源菌株中肠毒素基因检出率差异.方法 合成sea、seb、sec、sed和see五种肠毒素基因特异性引物,用常规PCR方法扩增食物中毒和食品监测来源菌株中各自肠毒素基因,同时采用mini-VIDAS检测食物中毒来源菌株中肠毒素.结果 110株菌株中有30株检出肠毒素基因,检出率为27.3％,肠毒素基因阳性菌株均只检出1种肠毒素基因.其中来自2起食物中毒的14株菌株均检出seb型肠毒素和相关基因,检出率为100％.来源于食品监测样本的96株菌株中有16株检出肠毒素基因,检出率为16.7％,包括sea型4株、seb型2株、sec型4株、sed型6株.结论 在宁波市食品监测中所分离的金黄色葡萄球菌所携带的肠毒素基因主要有sea、seb、sec和sed四型,而seb型肠毒素是引起金黄色葡萄球菌肠毒素所致食物中毒的主要因素.     

利用简并引物检测金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因

通过设计简并引物建立一种PCR技术同步快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A和B基因的方法。根据金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因编码序列,设计一对特异性简并引物SEAB来扩增靶基因片段,长度分别为105bp和135bp,通过对金黄色葡萄球菌肠毒素A、B菌株和4株对照菌株进行PCR检测,评价该引物的特异性;对金黄色葡萄球菌肠毒素B的DNA系列10倍稀释,对其灵敏性进行PCR检测。结果显示,金黄色葡萄球菌肠毒素A和B菌株的DNA检测结果呈阳性,4株对照菌株的检测结果呈阴性,通过基因测序证实了PCR产物的特异性,SEB的DNA最低检测浓度为3.58ng,整个检测过程不超过20h。建立了一个特异、快速灵敏的在同一条件下,金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因的PCR检测方法。     

六类食品中致病性细菌检测

为了解昌平区细菌对食品污染的特点，2004年采集6类305件食品，按照GB／T4789－2003食品微生物检验标准进行沙门菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生性李斯特菌、0157：H7大肠杆菌5种致病菌检测。菌株鉴定应用API细菌鉴定系统，肠毒素检测用minVIDAS测试系统，单核细胞增生性李斯特菌毒力基因测定采用聚合酶链反应（PCR）。金黄色葡萄球菌检出率为16．07％，其中生肉、生牛奶、生食水产品检出率比较高，分别为25％、16．98％、27．27％；散装熟肉制品、乳制品也有检出，分别为4.29％、5％。在检出的49株金黄色葡萄球菌菌株中有31株产生肠毒素，占63．26％，其中生、熟肉类肠毒素阳性25株；从奶类、生食水产品中各检出3株。单核细胞增生性李斯特菌检出34株，检出率为11．15％，其中生肉检出率高达20％，其次为散装熟肉制品（8．57％）；另外从淡水鱼中检出4株单核细胞增生性李斯特菌。28株单核细胞增生性李斯特菌毒力基因（hly、iap、prfA）检测全部阳性。生肉中检出一株肠炎沙门菌。未检出O157：H7大肠杆菌、副溶血性弧菌。昌平地区金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌对食物的污染比较严重，生食品与加工后食品的检出率差异有显著性。     

牛乳腺炎金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的克隆及序列分析

根据Genbank上公布的金黄色葡萄球菌肠毒素A的全序列,利用生物学软件Primer 5.0和oligo 6.0设计了一对特异性引物来扩增靶序列片段,经克隆预测序,结果表明扩增片段长度为101 bp,锦州分离株与标准菌株的基因片段序列相似性为100%,与Genbank上公布的金黄色葡萄球菌菌株(EF520720.1)SEA基因相似性达到99.14%。高度相似性结果为进一步研究建立分子检测技术奠定了实验基础。     

金黄色葡萄球菌五种肠毒素基因PCR-DHPLC检测方法的建立

本文设计合成了5种肠毒素基因的特异性引物,对PCR的退火温度、DNA模板量进行优化,建立了5种肠毒素基因(SEA、SEB、SEC、SED、SEE)的聚合酶链式反应-变性高效液相色谱(PCR-DHPLC)检测方法,并测定方法的灵敏度和特异性。结果表明建立的PCR-DHPLC检测方法的特异性很好,灵敏度可达到100cfu/m L。PCR-DHPLC方法具有快速、准确、高通量等优点,在进出口食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的检测上有很好的应用价值。     

校园周边熟食中金黄色葡萄球的分离及肠毒素基因检测

了解校园周边熟食中金黄色葡萄球菌的污染及其肠毒素基因的分布情况。采集校园周边农贸市场及其路边小摊的熟食样品89份,采用国家标准GB4789.10-2016和PCR方法进行金黄色葡萄球菌分离鉴定;采用PCR方法对分离菌株进行21种肠毒素基因检测。结果表明共分离出71株金黄色葡萄球菌,样品中金黄色葡萄球菌的污染率为79.78%,其中,农贸市场和路边小摊的熟食污染率分别为80.70%(46/57)和78.12%(25/32);检测的21种肠毒素基因中,sec、see、seh、sel、sep和ses未检出,其他15种基因型被检出,包括3种传统肠毒素基因和12种新型肠毒素基因。71株金黄色葡萄球菌中,46株菌株检出携带肠毒素基因,检出率为64.78%(46/71)。46株携带肠毒素菌株中,sex检出率最高为86.96%(40/46),sei和sem为32.61%(15/46),sen和seo为30.43%(14/46),set为21.74%,seg为13.04%,sea、seb和ser为10.87%,sej和seu为6.52%,sek和seq为4.34%,sed为2.17%。通过本研究发现校园周边农贸市场及路边小摊的熟食中金黄色葡萄球菌污染率和肠毒素基因携带率均较高,新型肠毒素基因检测率高于传统肠毒素基因型,研究结果为金黄色葡萄球菌食品安全提供参考依据。     

食源性致病菌快速检测试剂盒的研制

目的:研制一种快速检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的三重PCR试剂盒,并在山东泰安地区禽肉市场采样检测。方法:以沙门氏菌的invA基因、单增李斯特菌溶血素hlyA基因和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶Nuc基因序列作为目的基因片段金黄色葡萄球菌、沙门菌和单核细胞增生李斯特菌的特异性抗原基因序列,分别设计1对引物,优化各种工作条件,建立一种多重PCR诊断试剂盒。结果:该试剂盒特异性好,敏感性高,沙门氏菌检出极限为4.7cfu/mL,单核细胞增生李斯特菌检出极限17cfu/mL,金黄色葡萄球菌检出极限4.5cfu/mL,可在5h之内得到检测结果。在山东泰安地区取样58份,其中25份样品中检出沙门氏菌阳性,带染率43.1%;6份样品中检出单增李斯特菌阳性,带染率为10.3%;3份样品中检出金黄色葡萄球菌阳性,带染率为5.2%。结论:建立的试剂盒能同时检测上述3种病原菌,可用于食品及其原料的生物安全监测,也可用于兽医临床诊断。     

多重PCR检测金黄色葡萄球菌六型肠毒素基因的研究

目的:为了建立一种简单、快速检测金黄色葡萄球菌六型肠毒素基因的多重PCR方法。方法:根据相关文献和Genebank报道的编码金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E、H的基因序列,选择合成了6对特异性引物,建立多重PCR体系,并对反应条件进行了优化。结果:6对引物能同时特异地扩增出120、478、257、319、170、375bp的目的片段,表明6对引物具有良好的特异性。结论:成功地建立了一种同时检测金黄色葡萄球菌六型肠毒素基因的多重PCR方法,在金黄色葡萄球菌肠毒素快速筛查方面具有良好的应用前景。     

TaqMan探针荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素D

建立了检测乳中产肠毒素D的金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR方法,以SED基因为肠毒素D的检测靶序列,设计荧光定量PCR引物和Taq Man探针,将构建的重组质粒作为阳性对照,建立了对产肠毒素D金黄色葡萄球菌快速检测的Taq Man探针荧光定量PCR方法,并评价该方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示,Taq Man探针实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素D的方法具有极强的特异性,标准曲线的相关系数为0.999,最低可检测到40copies/m L的阳性质粒,检测乳中产肠毒素D金黄色葡萄球菌的灵敏度为1.0×102CFU/m L。该检测方法具有较好的特异性和灵敏性,在产肠毒素D金黄色葡萄球菌快速筛查方面具有良好的应用前景。     

基于TaqMan探针荧光定量PCR技术快速检测乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A

目的:建立检测金黄色葡萄球菌肠毒素A的Taq Man探针实时荧光定量PCR方法。方法:对金黄色葡萄球菌肠毒素A的基因序列分析、对比,设计特异性引物和Taq Man探针,建立对金黄色葡萄球菌肠毒素A的快速检测方法,并验证该方法的特异性、稳定性和灵敏性。结果:Taq Man探针荧光PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素A具有极强特异性,标准曲线相关系数为0.998,最低可检测出71个拷贝数的细菌DNA,检测乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A菌灵敏度为1.3×102CFU/m L,不同浓度质粒重复性扩增试验Ct值的变异系数均3%,显示了良好重复性。结论:Taq Man探针荧光定量PCR方法可以在6h内快速、准确地检出金黄色葡萄球菌肠毒素A,为金黄色葡萄球菌快速检测和食物中毒快速诊断提供技术支撑,推动了荧光PCR技术在食品安全检测方面的实践应用。     

熟食肉制品中金黄色葡萄球菌风险评估基础研究

通过对上海市场所监测的396份散装熟食肉制品样品进行金黄色葡萄球菌及其肠毒素分析检测,样品中金黄色葡萄球菌阳性数70分,检出率为17.7%,金黄色葡萄球菌阳性样品中,金黄色葡萄球菌肠毒素阳性数60份,检出率85.7%。按样品种类和样品来源进行分析,金黄色葡萄球菌阳性数比例最高的样品是熏烧烤制品,为23.9%;农贸市场样品金黄色葡萄球菌阳性数比例最高,为22.1%。熟食肉制品中存在金黄色葡萄球菌及其肠毒素污染而且污染程度较高,因此有必要建立熟食肉制品中金黄色葡萄球菌及肠毒素的剂量-反应关系和风险评估模型,加强对熟食肉制品中金黄色葡萄球菌及肠毒素的检验和对食品企业生产安全监管。     

The use of DNA probes for confirming enterotoxin production by Staphylococcus aureus and micrococci

DNA-DNA colony hybridization was employed to evaluate the results obtained by different immunological methods for detection of staphylococcal enterotoxin. Staphylococcus aureus strains tested for staphylococcal enterotoxin production by immuno-assays and micrococci not previously tested for staphylococcal enterotoxin production were examined for presence of the genes encoding for staphylococcal enterotoxin A, B, C and E by using three corresponding DNA probes. The staphylococcal enterotoxin A probe also detected staphylococcal enterotoxin E gene because of 100% homology. The optimal sensitivity plate method showed the best accordance between the immuno-assay and the hybridization reactions. The enzyme-linked immunosorbent assay detected 12.5 to 17% staphylococcal enterotoxin producers without hybridization reactions. The microslide gel double diffusion test and the reversed passive latex agglutination test showed rather poor accordance with the hybridization reactions. All 17 strains of different micrococci investigated were negative in hybridization with all three DNA probes.     

温州市食品中金黄色葡萄球菌污染状况及分子流行病学特征研究

目的了解温州市食品中金黄色葡萄球菌的污染状况,分析分离的金黄色葡萄球菌的耐药性、毒力基因分布及脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型特征。方法依据GB 4789.10—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》进行菌株分离鉴定,采用纸片法进行药敏试验,mini-VIDAS法和聚合酶链式反应(PCR)法分别进行肠毒素及其基因的检测,PFGE法进行分子分型。结果 4类食品388份样品中有16份样品检出金黄色葡萄球菌,检出率为4.12%,其中生畜肉和生禽肉检出率较高,分别为13.89%(5/36)和11.11%(4/36)。所有菌株均有不同程度的耐药,对青霉素耐药率最高(100.00%,16/16),其次为红霉素(56.25%,9/16),多重耐药率为18.75%(3/16),未检出对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌肠毒素及其基因检测阳性率均为56.25%(9/16),其中seb、seg基因检出率较高,均为37.50%(6/16)。PFGE图谱分为12种PFGE带型。结论金黄色葡萄球菌在温州市食品中存在一定的污染率,且具有分子多态性、产肠毒素率及毒素基因携带率较高的特征,提示存在潜在的食品安全隐患。     

Staphylococcal enterotoxin D production by Staphylococcus aureus FRI 100

Staphylococcus aureus FRI 100 is commonly used as a control strain for staphylococcal enterotoxin A (SEA) assays. When FRI 100 was used in PCR-based enterotoxin detection methods, the strain gave a positive result for both SEA and staphylococcal enterotoxin D (SED). Production of SED was confirmed by testing concentrated and unconcentrated culture supernatants with the TECRA staphylococcal enterotoxin visual immunoassay. SED was detected after 24 h of growth in Trypticase soy broth. Primers were created to amplify the entire sed gene by PCR for subsequent sequencing. The sequenced gene showed high similarity to a previously sequenced sed gene. The SED-like gene in FRI 100 exhibited four point mutations and two deletions. Changes in the FRI 100 open reading frame altered the primary structure of the SED-like protein, allowing for coding of only the first 150 amino acids followed by a stop codon. Because the SED active site is at the proximal end, where there was no change in DNA sequence, we conclude FRI 100 produces a variant form of SED. It is necessary to note that, when using FRI 100 as an SEA control strain, it does produce a variant of the SED protein, which exhibits immunological activity, and the sed-like gene is detected by commonly used PCR primers. This phenomenon may be an important general consideration when using PCR to characterize strains of toxin-producing S. aureus. S. aureus enterotoxin-positive PCR results should be confirmed by immunological techniques.     

Enterotoxin production by Staphylococcus aureus isolated from mastitic cows

Staphylococcus aureus is an important cause of mastitis in cows. The ability of S. aureus strains to produce one or more enterotoxins in milk and dairy products is linked to staphylococcal food poisoning. To determine whether staphylococci causing bovine mastitis could cause human foodborne intoxication, the production of staphylococcal enterotoxins A through D (SEA, SEB, SEC, and SED) by 160 S. aureus isolates was evaluated with the use of a reverse passive latex agglutination enterotoxin kit. All S. aureus strains were isolated over a 9-month period from 2,343 routine submissions of a composite quarter collection of individual mastitic cows at 18 dairy farms in the San Joaquin Valley in California. Prior to enterotoxin detection, isolates were grown by a method that enhances the in vitro synthesis of enterotoxin. Twenty-two of 160 S. aureus isolates produced enterotoxin. Seven produced SEC, 12 produced SED, and 3 produced both SEC and SED. None of the isolates produced SEA or SEB.     

辣椒制品金黄色葡萄球菌污染及肠毒素污染研究

了解辣椒制品金黄色葡萄球菌的污染状况,检测辣椒制品中金黄色葡萄球菌携带肠毒素的情况,为开展辣椒制品安全风险评估,企业及产品分类管理提供必要的依据.方法:参照GB 4789.10-2010对样品进行金黄色葡萄球菌分离、培养,用VITEK 2 compact全自动微生物鉴定分析系统进行生化鉴定,同时用全自动荧光酶标免疫测试系统(VIDAS 30)检测分离菌株携带肠毒素SEA-SEE情况.结果:从705份样品中共检出金黄色葡萄球菌21株,总检出率为2.98％.其中干辣椒制品未检出金黄色葡萄球菌、油辣椒检出率为3.34％,发酵辣椒制品检出率为5.63％,其他辣椒制品检出率为1.32％.21株金黄色葡萄球菌中11株葡萄球菌肠毒素阳性,总检出率为52.38％.其中油辣椒葡萄球菌肠毒素阳性率为46.67％,发酵辣椒制品葡萄球菌肠毒素阳性率为75.00％,其他辣椒制品葡萄球菌肠毒素阳性率为50.00％.辣椒制品样品产地涉及15个省(区、市),从4个省(区)产的辣椒样品中检出金黄色葡萄球菌并携带肠毒素.结论:不同类型辣椒制品污染程度存在差异,不同产地辣椒制品污染程度存在差异,辣椒制品存在金黄色葡萄球菌污染风险,并且产肠毒素的金黄色葡萄球菌占一定的比例.     

金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法及前处理技术研究进展

金黄色葡萄球菌是常见的食源性致病菌之一,肠毒素是导致金黄色葡萄球菌食物中毒的最主要原因。现有肠毒素检测方法包括免疫学方法、分子生物学方法、生物传感器方法和质谱法等。各方法均存在优劣,酶联免疫学作为现有国家、行业标准推荐方法,虽然灵敏度高,但存在交叉反应,且价格昂贵。而质谱分析技术法具有高通量、专属性强等优点,已成为近年肠毒素检测技术研究热点。由于食品基质含有脂质,糖类等多种复杂成分,对肠毒素的分离与检测具有较强的干扰,因此选择恰当的样品前处理方法是实现肠毒素的准确检测的关键。本文分别从肠毒素性质、肠毒素检测方法及原理、样品前处理方法等方面对现有研究进展进行阐述。通过对现有技术方法的比较分析,基于高效液相分离技术结合质谱检测技术开发肠毒素检测方法,不仅能够从食品中实现多种肠毒素的高效分离富集,还具有灵敏度高、专属性强等优点,是未来肠毒素检测方法的主要研究方向。     

鸡肉生产中分离金黄色葡萄球菌的基因分型与耐药性分析

为探究鸡肉制品在加工过程中金黄色葡萄球菌的肠毒素基因分布、分子分型和耐药性情况,本研究对某鸡肉制品加工厂的生产加工过程进行取样,通过DNA提取、PCR扩增nuc基因对金黄色葡萄球菌进行分离鉴定,然后分析肠毒素基因分布情况,对获得带有毒素基因的菌株进行多位点序列分型（MLST）和耐药性研究。结果表明,260份样本中分离到38株金黄色葡萄球菌（其中携带肠毒素基因的菌株有24株）,检出率为63.16%;共检测到7种毒素基因型,其中sed携带率最高（60.53%）,依次为seg（26.32%）、see（21.05%）、sei（18.42%）、sec（10.53%）、sea（7.89%）、seh（5.26%）,携带两种及以上肠毒素基因的菌株有14株（36.84%）。24株携带毒素基因的菌株MLST分型都为ST型,分为3种ST分型,16株为ST7序列型（66.67%）;5株为ST5序列型（20.83%）;3株为ST464序列型（12.5%）。耐药性分析实验结果表明,抑菌效果最好的抗生素是万古霉素,38株菌株都对其敏感（100%）;绝大多数菌株都对抗生素有耐药性,依次为青霉素G（86.84%）、环丙沙星（60.53%）、克林霉素（55.26%）、四环素（52.63%）;对3-6种抗生素耐药的金黄色葡萄球菌菌株分别占18.42%、15.79%、23.68%、7.89%。研究结果表明鸡肉产品中存在金黄色葡萄球菌污染的情况,并且其中存在携带多种类型肠毒素基因的菌株,也存在具有多重耐药性的菌株。     

鄂西北地区食源性金黄色葡萄球菌污染及耐药性和毒力基因分析

目的 了解鄂西北地区食源性金黄色葡萄球菌的检出情况、耐药性以及毒力基因分布特征。方法 从湖北省襄阳市、十堰市、随州市三地共采集303份食物样品进行金黄色葡萄球菌筛查,通过聚合酶链式反应(PCR)法进行耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的鉴定和毒力基因检测,并用K-B纸片扩散法进行耐药性测定。结果 303份样品中共有41份检出金黄色葡萄球菌,阳性率为13.53%,其中生肉制品检出率最高(23.91%,22/92)。在产肠毒素菌株中以携带产肠毒素基因sea的菌株最多,占87.80%(36/41)。携带表皮剥脱素基因eta和中毒性休克综合征毒素基因tst的菌株分别占97.56%(40/41)和7.32%(3/41)。同时携带3种及以上肠毒素基因的菌株占17.07%(7/41)。同时含有eta和tst的菌株占2.44%(1/41)。药敏结果显示,分离菌株对青霉素、四环素、红霉素和多西环素的耐药率分别为78.05%(32/41)、43.90%(18/41)、31.71%(13/41)和21.95%(9/41),对其他8种抗菌药物的耐药率均<20%。mecA基因检测表明,19.51%(8/41)的菌株为MRSA,且7株MRSA菌株来源于生肉制品和未加调料的素卤菜。结论 鄂西北地区食源性金黄色葡萄球菌具有较高的检出率,而且产毒株较多,并且存在多重耐药现象,相关部门需加强食品安全监测以控制该菌株的流行与扩散。