除草剂异丙甲草胺特异性抗体制备及免疫检测方法的建立

为检测食品中的异丙甲草胺农药残留,降低其对人体可能造成的危害,本文建立了基于抗体的酶联免疫分析方法。首先以除草剂异丙甲草胺、3-巯基丙酸为原料合成半抗原,经由氢核磁共振和质谱方法鉴定后,通过碳二亚胺（EDC）法将半抗原与载体蛋白偶联制备异丙甲草胺人工抗原,免疫新西兰大白兔获取抗体,通过棋盘滴定确定抗原抗体最佳稀释倍数,ELISA反应的抗体稀释液为PBS（1% PEG 6000）,药物稀释液为PBS（10%甲醇）,在此基础上建立间接竞争ELISA标曲,其IC50为14.64 ng/mL,检测限（limit of detection,LOD）为0.8 ng/mL,线性检测范围IC20~IC80为1.51~141.92 ng/mL。与14种结构类似物进行交叉反应,交叉反应率低于3%。向环境水样中添加异丙甲草胺,回收率为86.60%~102.16%,变异系数（RSD）为7.05%~13.30%。此抗体灵敏度高特异性好,可用于食品和环境中异丙甲草胺的监测。     

基于磁弛豫开关的免疫传感器检测自来水和脱脂牛奶中的雌二醇

目的 建立磁弛豫开关（magnetic relaxation switch,MRS）免疫传感器检测自来水和脱脂牛奶中雌二醇（Estradiol,E2）残留的检测方法。方法 首先通过1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC）和N-羟基丁二酰亚胺（n-hydroxysuccinimide,NHS）反应将雌二醇抗体（E2-Ab）和雌二醇全抗原（E2-BSA）分别偶联在磁纳米粒子（magnetic nanoparticles,MNP）表面,利用透射电子显微镜和动态光散射法等方法对偶联前后状态进行表征,而后添加游离E2于检测体系中与E2-BSA竞争反应1 h,将反应溶液转移到核磁共振管中,使用核磁共振交联密度分析测量仪器对横向弛豫时间（T2)进行测定,进而对E2定量分析。结果 在磁珠偶联抗体（MNP-Ab）浓度为5 μg/mL,磁珠偶联全抗原（MNP-E2-BSA)为50 μg/mL及孵育时间为90 min的优化条件下,该传感方法的横向弛豫时间变化（△T2）与E2浓度的对数在0.01~100 ng/mL的范围内呈良好的线性关系,检出限为0.01 ng/mL。对自来水样品和脱脂牛奶在0.5、5和50 ng/mL添加水平的回收率分别为93.55%~118%和91.25%~107.32%,相对标准差（relative standard deviation,RSD）小于4.82%。结论 该方法快速、准确、灵敏,为食品安全风险因子快速检测提供一种更为有效的手段。     

呋喃唑酮人工抗原的制备与鉴定

为了制备3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)的完全抗原,作者以乙醇肼和碳酸二甲酯为原料,首先合成了3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ),然后通过对醛基苯甲酸对AOZ进行衍生制得3-(4-羧基苯亚甲基)-氨基-2-恶唑烷酮(CPAOZ),以CPAOZ作为半抗原,经水溶性碳化二亚胺法(EDC),缩合酯化法(DCC)和混合酸酐法(MA)法3种方法分别与载体蛋白偶联,合成人工抗原。对于制备产物通过紫外光谱扫描分析进行了鉴定,3种抗原的偶联比率分别为8、12、17。采用3种抗原做为包被原,建立了酶联免疫(ELISA)抑制曲线。结果表明,对AOZ的半数抑制率(IC50)分别为12.9、7.6、1.1 ng/mL。采用混合酸酐法(MA法)制备的包被抗原与抗体具有较好的匹配性。3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ),是硝基呋喃类抗生素呋喃唑酮在动物体内的稳定代谢物,采用本试验制备的抗原,有望获得特异性更好的抗体。     

阿维菌素特异性半抗原合成及多克隆抗体的制备

合成具有阿维菌素特征结构的半抗原,采用活化酯法与载体蛋白BSA偶联制备人工抗原.通过免疫新西兰大白兔成功制备阿维菌素多克隆抗体,抗体效价达1∶20 000,用此抗体建立的阿维菌素间接竞争酶联免疫标准曲线IC50为1.92 ng/mL,IC15为0.13 ng/mL.     

孔雀石绿人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

通过研究孔雀石绿(MG)抗原的合成和多克隆抗体的制备,探索研究食品中孔雀石绿残留的检测方法。本实验先合成含有羧基的孔雀石绿半抗原(CMG),并用液-质联用法进行分析鉴定。半抗原经重氮化法处理后分别偶联两种载体蛋白BSA和OVA,并通过紫外分光光度法进行鉴定。与CMG标准品和两种载体蛋白的紫外吸收光谱相比,偶联物的吸收峰发生了明显的偏移,计算得免疫原的偶联比为10.6:1,说明偶联成功。通过免疫制备多克隆抗体,并通过间接ELISA法对CMG抗血清的效价进行检测,并进一步检测抗体的特异性,两只兔子的IC50值分别为8.1ng/mL和4.6ng/mL。     

氧氟沙星单克隆抗体的制备及生物条形码检测技术的研究

为了建立快速、高效的免疫检测方法，为小分子药物残留提供新方向。本实验首先采用碳二亚胺法合成氧氟沙星完全抗原，后用免疫原免疫小鼠，将特异性强的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合。通过杂交瘤细胞的多次“筛选-亚克隆”过程，制备氧氟沙星单克隆抗体。其次制备纳米金复合探针、磁性纳米探针，然后建立基于荧光定量PCR的生物条形码检测方法，在最优条件下采用荧光定量PCR生物条形码检测方法来间接测定氧氟沙星残留量。氧氟沙星线性回归方程为y=14.4263Logx+0.09184，R2=0.96。浓度范围在0.1-128 ng/mL时，检出限为0.17 ng/mL。结果表明基于荧光定量PCR生物条形码免疫分析方法检测氧氟沙星的结果可靠，能够应用于实际样品的检测中。     

4种邻苯二甲酸酯塑化剂人工抗原的合成及免疫检测

以4-硝基邻苯二甲酸为原料,衍生合成4 种结构类似物,并分别通过重氮化法和活泼酯法与载体蛋白牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）和卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）偶联制得人工抗原。利用紫外光谱扫描和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroporesis,SDS-PAGE）检测鉴定人工抗原,并用4 种与BSA偶联的人工抗原作免疫原免疫新西兰大白兔。利用酶联免疫吸附实验（enzymelinkedimmunosorbent assay,ELISA）检测抗体灵敏度和特异性。经紫外光谱和SDS-PAGE证实人工抗原偶联成功,经免疫分析法检测抗体效价,4-氨基邻苯二甲酸二丁酯-BSA（dibutyl 4-aminophthalate-BSA,DBAP-BSA）抗体效价达到1∶64 000,4-戊二单酰邻苯二甲酸二丁酯-BSA（dibutyl 4-carboxylphthalte-BSA,DBCP-BSA）、4-氨基邻苯二甲酸二异丁酯-BSA（diisobutyl 4-aminophthalate-BSA,DiBAP-BSA）和4-氨基邻苯二甲酸二环己酯-BSA（dicyclohexyl 4-aminophthalate-BSA,DCHAP-BSA）抗体效价均达到1∶128 000。DBAP-BSA、DBCP-BSA、DiBAP-BSA和DCHAP-BSA分别对邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate,DBP）、DBP、邻苯二甲酸二异丁酯（diisobutyl phthalate,DiBP）和邻苯二甲酸二环己酯（dicyclohexyl phthalate,DCHP）4 种抗体的IC50值为0.305、0.268、0.104、0.247 μg/mL。四者之间交叉反应率低,反应特异性较好。     

基于单克隆抗体的双酚A半抗原直接包被的酶联免疫吸附法的建立

传统的人工抗原包被酶联免疫吸附法(ELISA)依赖疏水相互作用将人工抗原与酶标板结合,会影响半抗原的呈现与识别,且多采用多克隆抗体为检测抗体,这些均会导致检测灵敏度下降和标准化难度增大。该研究选择双酚酸(BVA)作为双酚A(BPA)的半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原免疫BALB/c小鼠,获得一株可分泌BPA单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株。利用3-氨丙基三乙氧基硅烷硅化处理酶标板,将BVA直接包被在酶标板上,建立了一种基于MAb的半抗原直接包被的BPA间接竞争ELISA法。该检测方法最低检测限IC10为0.29 ng/mL,半数抑制率IC50为5.4 ng/mL,水样中加标回收率为94.04%~102.31%。与人工抗原包被BPA ELISA检测方法(IC10:0.5 ng/mL,IC50:16.65 ng/mL,水样中加标回收率为89.72%~105.25%)相比,检测灵敏度显著性提高。     

基于噬菌体展示纳米抗体的绿色免疫PCR检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇

目的：在获得脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）抗独特型纳米抗体的前期基础上,将纳米抗体作为酶标抗原的替代物,应用于荧光定量免疫聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）体系,实现DON的高灵敏、绿色免疫分析。方法：将特异性结合DON抗体的噬菌体展示纳米抗体（P-28）作为竞争抗原,以编码P-28纳米抗体的DNA为靶标,设计特异性PCR扩增引物,优化荧光定量免疫PCR退火温度、抗DON抗体浓度、P-28投入量等参数,建立基于间接竞争模式的荧光定量免疫PCR检测DON的方法。结果：本研究建立的荧光定量免疫PCR方法线性检测范围为0.1～1 000 ng/mL,IC50值为（3.96±2.21）ng/mL,最低检出限为0.048 ng/mL,并与其他真菌毒素无交叉反应。结论：该方法直接使用噬菌体展示纳米抗体作为竞争抗原的替代物,应用于免疫PCR体系,避免了使用传统的化学合成酶标抗原所带来的环境污染、操作毒性等缺陷,并具有良好的特异性及灵敏度。     

基于石墨烯/离子液体构建免疫传感器快速测定食品中黄曲霉毒素B1

采用壳聚糖、石墨烯和1-丁基-3-甲基咪唑基四氟硼酸盐复合膜修饰玻碳电极,包埋固定黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1,AFB1）抗体,构建了一种免疫传感器,用于快速测定食品中的AFB1。在pH值为7.0含1 mmol/LK3[Fe(CN)6]和0.1 mmol/L KCl的磷酸盐缓冲溶液中,基于AFB1抗体与抗原之间的特异性免疫反应,以K3[Fe(CN)6]为探针,运用循环伏安法和差分脉冲伏安法研究免疫反应对传感器响应电流的影响。在优化实验条件下,免疫传感器峰电流的降低值随溶液中AFB1质量浓度对数的增大而增大,且二者在0.1～8.1 ng/mL范围内呈线性关系,其检出限为0.04 ng/mL（RSN=3）。该免疫传感器的稳定性和重复性较好,利用该法对花生和玉米油样品中AFB1进行检测,回收率为94.73%～104.41%,检测结果与高效液相色谱法基本一致,用于食品中AFB1的快速检测是可行的。     

三唑磷多克隆抗体的制备及鉴定

采用活泼酯法将三唑磷半抗原(TZPM-Hap)与牛血清蛋白(BSA)和卵血清蛋白(OVA)偶联,制备出免疫抗原(TZPM-A-BSA)和包被抗原(TZPM-A-OVA),经紫外扫描证明人工抗原合成成功.用免疫抗原TZPM-A-BSA免疫雌性Balb/c小鼠,获得了特异性的三唑磷多克隆抗体.以所获得的抗体建立间接竞争酶联...     

玉米赤霉烯酮多克隆抗体的制备及特性分析

合成玉米赤霉烯酮半抗原,应用液相色谱-质谱联用法进行鉴定,并采用活泼酯法将半抗原与载体蛋白OVA或BSA偶联,分别作为免疫原或包被原,并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和紫外扫描法鉴定偶联效果,免疫3只BALB/c小鼠,制备玉米赤霉烯酮多克隆抗体。结果表明:抗血清效价最高达1∶32 000,以此多抗建立的玉米赤霉烯酮间接竞争标准曲线IC50为39.8ng/mL,IC10为0.71ng/mL,多抗与玉米赤霉烯酮类似物β-zearalenol、zear-alanone、α-zearalanol、β-zearalanol交叉反应率分别为4.80%,3.07%,0.96%,0.09%。说明试验成功制备了玉米赤霉烯酮人工抗原及高特异性多克隆抗体。     

重金属铅多克隆抗体的制备及鉴定

目的：合成铅离子完全抗原,并对其进行鉴定;用合成的完全抗原免疫Balb/c 小鼠制备多克隆抗体,鉴定效价和特异性。方法：用双功能螯合剂p-SCN-Bn-DTPA 将Pb2+ 与载体蛋白BSA 和OVA 偶联在一起,合成免疫抗原(Pb-DTPA-BSA)和检测抗原(Pb-DTPA-OVA),并通过SDS-PAGE、紫外扫描、电感耦合等离子体(ICP) 检测抗原中Pb2+ 含量,以及通过免疫Balb/c 小鼠,采集血清进行间接ELISA 和竞争ELISA 检测。结果：两种合成的抗原相对于各自的载体蛋白均出现了蛋白条带滞后,紫外吸收峰偏移等现象;免疫的4 号和5 号Balb/c 小鼠的抗血清效价达1:400000;与OVA 无交叉反应,ELISA 检测IC50 值为1.5ng/mL,与Fe3+ 有近5% 的交叉反应,与其他重金属离子的交叉反应均小于1%。结论：铅离子多克隆抗体制备成功。     

半抗原免疫分析在食品安全检测中的应用

综述近几年来关于小分子半抗原的设计、人工抗原合成的研究,以及人工抗原合成中尚存在的问题和计算机模拟技术在半抗原合成中的应用;介绍多克隆抗体、单克隆抗体、卵黄抗体及基因工程抗体在食品安全检测中的应用,分析近年来ELISA、胶体金免疫层析和新兴的免疫传感器技术研究与应用现状和发展趋势。半抗原免疫学检测方法具有较低的检测极限、快速、方便、低廉等优势,是食品安全检测的发展方向。半抗原合成的可控设计、有效抗体的规模化生产,通过与新型免疫分析技术结合以期达到高通量、低成本、实时多重检测是今后食品安全免疫学检测中重要的技术突破点。     

丙烯酰胺多克隆抗体的制备

通过活化酯法制备了三种丙烯酰胺人工抗原并进行动物免疫,得到高效价抗体,经测定三种抗血清效价分别为1∶32000、1∶40000、1∶80000.比较三种人工抗原,使用对巯基苯甲酸衍生方法获得的抗体对衍生产物表现了很高的特异性,经测定针对1μg/mL衍生产物的抑制率达到80.7％,而针对丙烯酰胺及对巯基苯甲酸均无交叉反应.本研究为建立快速检测食品中丙烯酰胺残留的ELISA方法奠定基础.     

西地那非多克隆抗体的制备及特异性分析

目的为了研究开发一种具有高灵敏度、高特异性的西地那非(sildenafil,SD)多克隆抗体。方法本文通过人工合成西地那非半抗原(SDH)和西地那非抗原(SDH-BSA),然后经免疫兔子,制备了SD多克隆抗体,并对制得的抗体的特异性进行了分析。结果免疫后产生了SD多克隆抗体,抗体的效价为3.8×105,线性检测范围为0.02~3.8 ng/m L,抗体除与瓦地那非具有较高的交叉反应率外,与红地那非、他地那非等结构类似物交叉反应率均较低。结论采用本方法制备的SD多克隆抗体具有较高的特异性和灵敏度,可用于SD快速检测试剂盒的开发。     

保健酒中萘普生免疫学检测方法的建立

萘普生是疗效显著但有一定副作用的非甾体抗炎药物,近期频繁发现不法生产者在抗风湿保健酒中添加萘普生增加治疗效果,这种现象对消费者健康构成威胁。为了究建立快速检测萘普生的免疫学方法, 本文以活泼酯法将萘普生分别连接到BSA制备免疫抗原,连接到OVA上制备检测抗原。用免疫抗原免疫家兔制备多克隆抗体,配合检测抗原经条件优化建立竞争抑制酶联免疫吸附检测方法。实验结果表明,检测体系IC50值为23.0 ng/mL,最低检测限为3.1 ng/mL,检测保健酒中萘普生加标回收率在87.3~102.1%,变异系数小于8.9%,与8种相关药物交叉反应率都小于0.05%。且与用ELISA方法与HPLC检测市售保健酒,1例阳性和19例阴性结果全部吻合。因此,本文所建立的免疫学检测萘普生的实验方法,具有高灵敏度和特异性,能够满足保健酒萘普生快速筛选的需要。     

保健酒中舒林酸免疫学检测方法的建立

舒林酸是常用非甾体抗炎药物,近期常发现不法生产者在保健酒中添加舒林酸增加治疗效果,这种现象对消费者健康构成威胁。为了建立快速检测舒林酸的免疫学方法,本文以活泼酯法将舒林酸分别连接到BSA制备免疫抗原,连接到OVA上制备检测抗原。用免疫抗原免疫家兔制备多克隆抗体,配合检测抗原经条件优化建立竞争抑制酶联免疫吸附检测方法。实验结果表明,检测体系IC50值为18.1 ng/mL,最低检测限为3.5 ng/mL,检测保健酒中舒林酸加标回收率在82.1-94.2%,变异系数小于7.6%。与8种相关药物交叉反应率都小于0.05%。与用ELISA方法与HPLC检测市售保健酒,2例阳性和28例阴性结果全部吻合。因此,本文所建立的舒林酸免疫学检测方法具有灵敏度高和特异性强的特点,能够满足保健酒中快速筛选舒林酸的需要。     

抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的制备

为了制备赭曲霉毒素A多克隆抗体,采用戊二醛法合成赭曲霉毒素A-BSA人工抗原,通过紫外扫描法鉴定半抗原与载体蛋白偶联效果.合成的人工抗原用弗氏佐剂乳化后免疫Balb/c小白鼠,4次免疫后眼球下缘采血,分离血清.试验结果表明,免疫后产生了抗赭曲霉毒素A-BSA的特异性多克隆抗体,抗体效价为1:8100,赭曲霉毒素A的最低...