应用原生质体融合技术筛选豆豉芽孢杆菌

采用原生质体融合技术,以枯草芽孢杆菌Bl⑥为出发菌株,与纳豆芽孢杆菌进行原生质体融合,最终筛选获得融合菌株11株.其中以枯草芽孢杆菌B1⑥和纳豆芽孢杆菌融合获得的RH3519菌株纯种发酵豆豉的品质最佳,且显著优于原始菌株和自然发酵豆豉.RH3519菌株的生理生化鉴定表明,属于芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其遗传稳定性高,发酵不产气,发酵特性可满足工业生产的要求.     

醋醅中分离菌株W321种属鉴定的研究

试验以从醋醅中分离纯化到的菌株W321为研究对象,为进一步开发利用这一菌株,根据菌株W321的形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列,对其进行种属鉴定的研究.经形态与生理生化鉴定菌株W321属于芽孢杆菌属,16S rDNA序列与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的同源性达到了99％,表明与枯草芽孢杆菌极为相似,因而将菌株W.鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).     

乳酸芽孢杆菌SC复合诱变与选育

以乳酸芽孢杆菌SC为出发菌株,紫外线-亚硝基胍复合诱变出200个菌株,进行培养液pH值、抑菌活性、芽孢形成率的测定,再进行稳定性和急性毒性试验.结果表明,乳酸芽孢杆菌SC27诱变菌株与出发菌株比较,培养液pH值降低了10.8%,对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径增大了23.9%,对大肠埃希菌的抑菌圈直径增大了20.7%,芽孢形成率达到36.1%;该菌株产酸、产活性物质及芽孢形成的性能稳定,并属于无毒物质.     

赤水晒醋中增黏微生物的分离鉴定及特性研究

从变质赤水晒醋中分离筛选出导致黏度增加的菌株N3、N5、N7和N11,检测其生理生化特征,并进行16S rDNA基因序列分析及生长特性研究。结果表明,经过生理生化特征分析、16S rDNA基因序列分析以及系统发育树分析鉴定菌株N3为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、菌株N5为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、菌株N7为索诺拉沙漠芽孢杆菌（Bacillus sonorensis）、菌株N11为酸居芽孢杆菌（Bacillus acidicola）。菌株N3、N5、N7和N11的最适生长温度均为45 ℃;菌株N3、N11的最适生长pH值为5.5;菌株N5、N7的最适生长pH值为4.5;菌株N3、N7、N11最适生长盐度（NaCl含量）为1%,菌株N5最适生长盐度（NaCl含量）为2%;4株菌在LB液体培养基中均具有较快的生长速度和较强的繁殖能力。     

烟草内生青枯病拮抗细菌的筛选和初步鉴定

为了获得防治烟草青枯病新途径,从湖南桂阳烟草青枯病重病区采集的健株上,共分离到内生菌株160个。经对峙培养法测定,32个菌株对烟草青枯菌有拮抗作用,其中H-1、H-9和H-11有强拮抗作用,抑菌圈分别为3.0、3.0、4.5 mm。根据其形态特征和生理生化性状,初步鉴定内生菌H-1为枯草芽孢杆菌,H-9和H-11为短芽孢杆菌。     

自然发酵甜面酱中芽孢杆菌的分离、筛选及鉴定

利用10倍梯度稀释法涂布平板,从成熟的自然发酵甜面酱中分离、筛选出芽孢杆菌,共计得到13株菌株。通过对其进行菌落、显微形态观察、生理生化实验鉴定和16SrDNA片段扩增及序列分析技术分析,最终确定13株菌株中:菌株B2,B4,B5,B6,B7,B8,B11,B12为枯草芽孢杆菌,菌株B3,B10,B13为解淀粉芽孢杆菌,菌株B1为特基拉芽孢杆菌,菌株B9为短小芽孢杆菌,所得菌株为进一步探究其在甜面酱发酵过程中的作用机理奠定了基础。     

产淀粉酶芽孢杆菌的分离和鉴定

从土壤中分离筛选出产淀粉酶的菌株,经淀粉培养基初筛后,采用DNS法对发酵提取的粗酶液进行总酶活和α-淀粉酶活力的测定,通过形态观察和生理生化反应对筛出的菌株进行鉴定。结果表明:分离到4株产淀粉酶芽孢杆菌,测得其透明圈直径与菌落直径比值在1.7~3.5之间,其中有2株菌株产淀粉酶能力较高,总酶活达到19.760 U/mL和15.432 U/mL;4株芽孢杆菌所产α-淀粉酶酶活在6.4 U/mL~10.4 U/mL之间。经鉴定,1株为枯草芽孢杆菌,3株为蜡样芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌的产淀粉酶能力优于蜡样芽孢杆菌。     

芽孢杆菌TF18的鉴定以及系统发育分析

目的对一株透明质酸酶高产菌株进行鉴定及系统发育分析。方法收集本公司空气沉降菌分离得到一株产透明质酸酶细菌TF18,对此菌株进行鉴定及系统发育分析。利用细菌16S r DNA通用引物进行PCR扩增,以获得该菌株的16S rDNA基因序列,并进行序列分析及系统发育分析;结合其形态特征、培养特征、生理生化特征,确定其种属。结果菌株TF18菌体杆状、好氧、产芽孢,应属于芽孢杆菌属,生理生化实验及系统发育分析结果也表明,此菌株属于芽孢杆菌属,但又不同于该属的其他已知菌种,故判定为新种。结论从自然界筛选得到的透明质酸酶高产菌株Bacillus sp.TF18为芽孢杆菌属一新种,为开发利用此菌种生产制备透明质酸酶及寡聚透明质酸(o-HA)提供了理论基础。     

一株海洋拮抗菌的筛选与鉴定

通过平板分离、摇瓶发酵,从样品中分离到1株对枯草芽孢杆菌、藤黄八叠球菌、大肠杆菌等指示菌具有较强拮抗作用的菌株HY4,通过菌落形态、镜检、生理生化试验和对菌株16S rRNA基因序列遗传分析对菌株进行鉴定,发现该菌株跟芽孢杆菌属（Bacillus）的多数菌株序列有99%的相似性,将该菌株命名为芽孢杆菌HY4。当培养时间为48 h时,菌株的生物量达到最大值,OD600nm为2.49,此时菌株对枯草芽孢杆菌和藤黄八叠球菌的抑菌活性也达到最高,透明圈直径分别为1.38 cm和1.13 cm,当培养至60 h时,菌株对大肠杆菌的抑菌活性也达到最大,透明圈直径为1.13 cm,之后随着培养时间的延长,抑菌活性反而逐渐降低。     

α-淀粉酶和蛋白酶高产菌株的诱变选育

以从烟叶表面筛选得到的巨大芽孢杆茵Bck(Bacillus megatherium)为出发菌株,经理化诱变处理,采用透明圈法进行初筛,即在淀粉培养基和蛋白培养基平板上挑取Hc值(透明圈直径与菌株直径之比)较大的菌株.然后对这些菌株进行摇瓶复筛,测定发酵液α-淀粉酶和蛋白酶的活性,得到酶活性较高的菌株B8.其产生的α-淀粉酶活性是BCK的1.964倍,蛋白酶活性是BCK的2.266倍.该菌株能稳定遗传.经五代传代培养后,其产生的α-淀粉酶和蛋白酶活性分别稳定在2.821～3.273U/mL和21.21-27.36 U/mL范围内.     

荧光假单胞菌缓解植烟土壤酸化效果及对烟草青枯病的防治作用

为挖掘具有缓解土壤酸化能力的微生物菌株,开发新型酸性土壤改良剂,通过原位培养从恩施烟区酸化植烟土壤中筛选获得一株荧光假单胞菌SSW-11(Pseudomonas fluorescens SSW-11),并采用盆栽试验和大田试验评价菌株发酵液灌根对酸化植烟土壤的改良效果以及对烟草青枯病的防效。结果表明：(1)菌株SSW-11发酵液对复合有机酸和复合肥料造成的土壤酸化有一定的缓解作用,土壤pH平均提高0.18;(2)菌株SSW-11发酵液灌根处理后42 d内,旺长期烟株根区酸化土壤pH显著提高（平均提高0.47）;(3)菌株SSW-11发酵液可显著降低成熟期烟草青枯病的发病率和病情指数,对烟草青枯病的防效达52.01%。荧光假单胞菌SSW-11对缓解植烟土壤酸化和防治烟草青枯病具有较好的效果。     

烟草灰霉病复合生防细菌的筛选

采用平板对峙法和孢子萌发法,测定470株烟草内生细菌对烟草灰霉病菌的抑菌活性,初筛出抑菌作用较强的27株菌株;利用烟叶组织法进行复筛,获得防治效果超过50%的12株菌株,属于芽孢杆菌属或假单胞菌属;测试了7株生防菌之间的亲和性,除菌株Y98外,其他菌株之间均表现亲和;根据菌株亲和性及生防效果,选择5株生防菌株进行混配,测定其对烟草灰霉病的防治效果,发现芽孢杆菌菌株Y11与假单胞菌菌株Y141在其比例为2:1时的防效较好,且高于单菌株处理。      

一株突破va基因型烟草抗性的PVY病毒分离物的鉴定

  背景和目的  近来,能突破va基因型抗性的马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)毒株在烟草上不断出现。2016年,我们分离到一株抗性突破的毒株PVY-CJ,本文对该病毒分离物进行了验证和鉴定。  方法  采用病毒重新接种、多重RT-PCR、RT-PCR分段扩增病毒全长基因组、PVY病毒分子进化分析及病毒蛋白VPg蛋白序列比对等方法对PVY-CJ毒株进行了验证和鉴定。  结果  三种重新接种了PVY-CJ的va基因型烟草品种均发病。多重RT-PCR结果将PVY-CJ鉴定为PVYNTN株系。序列分析表明,PVY-CJ全长基因组包含一个全长9180 nt的开放读框,其编码一个3060 AA的多聚蛋白。分子进化分析进一步验证了其归类于PVYNTN株系。相比其他PVYNTN株系毒株,PVY-CJ的VPg蛋白105位氨基酸出现了一个由赖氨酸到谷氨酸的替换,而这一氨基酸替换导致了其对va基因来源抗性的突破。  结论  我们首次报道并鉴定了国内一株能突破va基因型烟草抗性的PVY毒株—PVY-CJ。这为进一步研制PVY抗病烟草品种提供了材料。      

巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium，Bm）的抑菌活性及定殖规律分析

为进一步明确巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium,Bm）菌株对烟草主要病害的抑制效果,利用半叶法、对峙平板法和抑菌圈法研究了Bm对烟草花叶病毒（TMV）、黑胫病菌和青枯病菌的抑制作用;利用抗生素诱导筛选抗药性标记菌株,研究其在烟草根际土壤和叶面上的定殖规律;同时制备了生防菌发酵液制剂,测定其田间防治效果。结果表明:Bm发酵液和发酵上清液对烟草花叶病毒的抑制率分别为88.4%和74.3%;Bm无菌发酵上清液对黑胫病菌菌丝生长的抑制率为67.5%,对青枯病菌的抑菌圈直径为10.03 mm。抗药性菌株Bm-rif生长性状与野生型无差异。室内定殖试验结果显示,Bm-rif稳定定殖菌量在非灭菌土壤中为0.04×105 cfu/g,在灭菌土壤中为0.47×105 cfu/g,均显著高于叶面定殖菌量;接种TMV-GFP前24 h叶面喷施发酵液对TMV初侵染的抑制率为44.04%。菌株发酵液稀释后喷淋烟株茎基部,对烟草黑胫病和青枯病的田间防治效果分别为68.09%和51.02%。因此,Bm具有抑菌活性且能在烟草根际土壤中有效定殖,具有开发为生防菌剂的潜力。      

烟草花叶病毒强、弱毒株对烟草植株的影响

分别接种烟草花叶病毒强毒株（TMV-W）、诱变获得的两个弱毒株（TMV-017、TMV-152）于普通烟（品种为K326）。间接ELISA法测定了强，弱毒株在接种叶上的增殖速率，同时考察了叶绿素a、叶绿素b，叶绿素，可溶蛋白含量的变化。实验发现强毒株在接种后第2d就可检测到，而弱毒株在第3d被检测到，弱毒株在烟草植株体内的稳定浓度低于强毒株，分别受强，弱毒株侵染的烟草叶片中的叶绿素a,叶绿素b，叶绿素含量都有所下降，但强毒株引起的下降幅度最大。受强，弱毒株分别侵染的烟叶中可溶性蛋白含量均发生变化，初期都有所升高，之后，弱毒株随着侵染时间的延长而有所下降，而强毒株下降后又有所回升。     

转几丁质酶基因烟草遗传稳定性研究

从转几丁质酶基因烟草株系(NPTII基因是选择标记基因)对卡那霉素的抗性,及外源几丁质酶基因表达蛋白的活性(Western Blot检测)两个方面对转基因株系的遗传稳定性进行了分析研究。在卡那霉素抗性检测试验中,检测了13个T₂转基因株系,其中9个株系被检测种子100%对卡那霉素(100 mg/L)具有抗性;T₃和T₄转基因株系各检测了10个,100%被检测种子在含卡那霉素100 mg/L的MS培养基上长成了烟苗。Western Blot检测了11个T₂株系,检测结果表明,6个株系被检测植株100%含有外源几丁质酶蛋白,2个株系被检测植株80%含有外源几丁质酶蛋白,2个株系被检测植株50%含有外源几丁质酶蛋白,1个株系被检测植株19.05%含有外源几丁质酶蛋白。在温室内将转基因烟草与未转基因烟草密植在一起,种植2代,烟株开花期模仿自然风力对烟株吹风,进行了转基因烟草是否可以通过花粉进行基因漂移的研究。研究结果表明,在自然风媒条件下未发现转基因烟草可进行基因漂移。      

低钾胁迫下烤烟苗期叶片的差异蛋白及其生物信息学分析

  目的  探究低钾胁迫下烤烟苗期叶片的差异表达蛋白, 并对其进行生物信息学分析, 为烟草品种选育与栽培调控奠定基础。  方法  分别在低钾和正常钾环境下培育烤烟高钾品系HKDN-5, 提取苗期烟叶总蛋白, 进行酶解, 液相色谱串联质谱和label-free蛋白定量分析。  结果  (1) 与正常钾相比, 低钾胁迫中发现101个差异表达蛋白(差异倍数大于1.5倍), 其中表达下调的有52个, 上调的有49个。(2)差异表达蛋白主要参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢和脂质代谢等途径。其中, 上调蛋白具有碳水化合物运输和代谢相关功能的数量最多, 下调蛋白具有翻译后修饰、蛋白质转换和伴侣蛋白等相关功能的数量最多。  结论  物质代谢和应激反应相关蛋白在低钾胁迫下发生差异表达。      

无致病力青枯菌株对烟草青枯病的控制作用

为进一步揭示无致病力菌株对烟草青枯病的控病机理,以无致病力青枯菌株为材料,针对烟草青枯病进行了温室控病及田间小区试验,并通过抗药性标记测定其抗药性突变菌株在烟株体内的定殖状况,同时分析处理后烟株体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)的活性变化。结果显示:无致病力菌株Tbw1-7-3在温室盆栽条件下对青枯病的相对防效达89.4%,其田间防效在发病初期10~20 d与药剂农用链霉素处理间无明显差异,且其抗药性突变株在烟株根表和体内可短暂定殖。同时菌株Tbw1-7-3能提高寄主中PAL、POD和PPO 3种酶活性及促进病程相关蛋白(PRP)的积累。无致病力菌株对烟草青枯病具有较好的控制作用,以菌株Tbw1-7-3的防效最优。田间试验也显示Tbw1-7-3菌株在发病初期具有良好的控病效果。无致病力青枯菌株的控病机理可能兼有占位效应及诱导抗病性。      

枯草芽孢杆菌分离鉴定及其对烟叶化学成分和吸味品质的影响

为研究枯草芽孢杆菌对烟叶化学成分和吸味品质的影响,从初烤后烟叶中筛选出一株微生物（H11）,结合菌株形态和16S rDNA序列分析,初步鉴定为枯草芽孢杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp. subtilis）;用H11对20 kg河南平顶山低等级烟叶（2017 DCFB）发酵30 h,对比分析发酵前后烟叶感官质量、常规化学成分、中性香味成分的变化,并采用宏基因组测序技术,分析了发酵前后烟叶表面微生物群落变化,探讨了酶在烟叶发酵中的作用。与发酵前相比,烟气透发性好、甜感增强、香气质提升、香气量增加;水溶性总糖和还原糖含量（质量分数）分别增加了2.52%和1.92%;（E）-β-大马酮、二氢猕猴桃内酯和巨豆三烯酮C等香味成分含量（质量分数）分别增加了25.92%、10.57%和12.15%;烟叶表面微生物数量明显减少,芽孢杆菌属（Bacillus）微生物丰度增加至微生物总量的76%。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）对烟叶化学成分和吸味品质有重要影响,且具有发酵时间短和处理量大等特点,可为微生物发酵低等级烟叶提供参考。