高温大曲发酵过程中微生物多样性研究

利用高通量测序技术对在发酵和储存过程中的高温大曲微生物的多样性进行研究分析。经研究发现:大曲内细菌的多样性呈波浪形变化,在门、纲、目、科、属级水平上,厚壁菌门、芽孢杆菌纲、芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、高温放线菌科、乳杆菌科、明串珠菌科、乳杆菌属和魏斯氏菌属占优势。     

高通量测序技术解析扳倒井浓香型白酒窖泥原核微生物群落结构

通过Illumina Miseq 2×300bp高通量测序技术对山东扳倒井股份有限公司浓香型白酒窖泥原核微生物群落结构进行了研究。发现:窖泥中细菌主要为梭菌纲(Clostridia)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、甲烷杆菌纲(Methanobacteria)和芽孢杆菌纲(Bacilli);古菌主要为甲烷微菌纲(Methanomicrobia)、甲烷杆菌纲(Methanobacteria)和热原体纲(Thermoplasmata)。同时得出窖池位置对窖泥原核微生物群落结构的丰富度和多样性影响最大,压池时间越长窖泥菌落结构的丰富度和多样性越高,多粮发酵窖泥菌落结构与单粮发酵窖泥菌落结构既有特异性也保持相关性。     

环介导等温扩增技术快速检测食品中的耐热芽孢菌

针对食品中的好热黄无氧芽孢菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌等耐热芽孢菌,以spo0A基因部分序列为靶基因,设计了一套引物,能够同时对这3种菌进行环介导等温扩增(LAMP)检测,扩增只需要60min。该法快速并具有良好的特异性,灵敏度可达到8cfu/mL,是普通PCR的10倍。DNaseI的使用与LAMP结合,可有效降解死菌游离DNA,消除其影响。结果表明,该方法用于奶粉及罐头制品中耐热芽孢菌的检测,具有灵敏度高、特异性强、检测速度快等优点,在食品微生物检测中拥有广阔的前景。     

乳铁蛋白对Dex模型小鼠肠道菌群调控研究

目的：探索乳铁蛋白是否能够调节Dex模型小鼠肠道微生态结构。方法：选取40只SPF级C57BL/6小鼠，将小鼠随机分为对照组(10只)与造模组(30只),经过4周模型构建，将造模组随机分成DEX组(模型组，10只)、LF组(乳铁组，10只)和LF+WP组(乳铁+乳清组，10只),通过乳铁和乳清连续干预3周后采集样品进行肠道菌群分析。结果：乳铁蛋白能改变Dex模型小鼠肠道菌群，与DEX组相比，梭菌纲(Clostridia)、毛螺菌目(Lachnospirales)、颤螺旋菌目(Oscillospirales)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)的相对丰度升高；芽孢杆菌纲(Bacilli)、乳杆菌目(Lactobacillales)、丹毒丝菌目(Erysipelotrichales)以及乳杆菌科(Lactobacillaceae)相对丰度下降。结论：大剂量乳铁蛋白能够改变Dex小鼠肠道微生物结构。     

山西老陈醋大曲细菌群落结构及多样性研究

山西老陈醋是以大曲为发酵剂,自然固态发酵的传统酿造食品。大曲中的微生物在其发酵过程中起重要作用。为了分析山西老陈醋大曲细菌群落结构及多样性,提取山西老陈醋大曲样品总DNA,应用Miseq高通量测序平台结合16S rDNA序列分析大曲细菌群落结构。大曲中的细菌种类丰富,包括:厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门,其中厚壁菌门和变形菌门为优势菌门,分别占大曲总细菌的69.67%和29.17%,放线菌门及拟杆菌门仅占大曲总细菌的0.86%和0.28%。厚壁菌门上仅检测到杆菌纲,主要包括乳杆菌属(32.82%)及芽孢杆菌属(29.45%)。在变形菌门上检测到γ-变形菌纲,主要包括泛菌属(27.36%)和不动杆菌属(0.80%)。放线菌门与拟杆菌门结构简单,分别检测到放线菌纲和黄杆菌纲,属水平上分别检测到糖多孢菌属(0.59%)和黄杆菌属(0.27%)。本研究揭示了山西老陈醋大曲细菌群落结构,为明确山西老陈醋微生物酿造机理提供基础数据。     

解淀粉芽孢杆菌单链核苷酸介导的同源重组系统的构建

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一类重要的工业微生物,在农业、医药和食品等领域有广泛用途。为了开发高效的基因操作技术,在解淀粉芽孢杆菌中引入单链核苷酸(ss DNA)介导的同源重组方法。首先,通过敲除mut S基因干扰解淀粉芽孢杆菌的错配修复系统,然后导入单链结合蛋白(Beta)表达质粒,构建了宿主菌B.amyloliquefaciens XH7(mut S-,bet+)。其次,通过设计88 bp的ss DNA电转化导入以上构建的宿主菌中实现了以rpo B基因为靶点的有效同源重组,转化株产生利福平抗性。实验优化了ss DNA介导同源重组的参数:75μg的ss DNA,电转细胞复苏时间为6~12 h。本研究首次成功实现了ss DNA同源重组技术在解淀粉芽孢杆菌的应用,对解淀粉芽孢杆菌和其它难转化的芽孢杆菌属进行有效的遗传操作手段提供新的思路。     

北宗黄酒麦曲微生物的分离鉴定

利用梯度稀释法和划线纯化法对麦曲中的微生物进行分离纯化,得到7株细菌和5株真菌。通过形态学特征观察和分子生物学方法进行菌种鉴定,细菌分别为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、根际芽孢杆菌(Bacillus rhizosphaerae)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)。真菌分别为米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、根菌属(Talaromyces radicus)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、伞状犁头霉(Absidia corymbifera)。     

基于高通量测序技术分析恩施州淡豆豉的细菌多样性

以恩施州不同产地5 种细菌型淡豆豉作为实验对象,利用Illumina PE250高通量测序技术,对5 种淡豆豉的细菌群落结构及多样性进行研究。结果表明：5 种恩施州豆豉的微生物组成多样,共鉴定出17 门、24 纲、43 目、78 科、152 属以及93 种。其中核心优势细菌门为厚壁菌门（Firmicutes）,其次为变形菌门（Proteobacteria）、蓝细菌门（Cyanobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）,优势菌属为芽孢杆菌属（Bacillus）的嗜热淀粉芽孢杆菌（Bacillus thermoamylovorans）和史密斯芽孢杆菌（Bacillus smithii）。各样品间,优势菌属相同,但相对丰度差异较大,其余次要菌属的种类和相对丰度均存在较大差异,显示出恩施淡豆豉菌群结构的多样性。     

Biolog GEN Ⅲ微孔板在烟草青枯病、黑胫病生防细菌鉴定中的应用

采用Biolog全自动微生物鉴定系统的Biolog GEN III微孔板对24株烟草青枯、黑胫病未知生防细菌进行了鉴定。结果表明,鉴定准确率为100%,其中解淀粉芽孢杆菌12株(Bacillus amyloliquefaciens)、饲料类芽孢杆菌3株(Paenibacillus pabuli)、枯草芽孢杆菌2株(Bacillus subtilis)、萎缩芽孢杆菌2株(Bacillus atrophaeus)、地衣芽孢杆菌2株(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌1株(Bacillus pumilus)、亨氏普罗威登斯菌1株(Providencia heimbachae)。     

婴幼儿配方奶粉中的菌相分析

从市场上随机抽取不同生产厂家的婴幼儿奶粉,通过菌落总数测定,单菌落的分离,利用细菌通用引物27f/1492r对不同菌株进行16S rDNA片段扩增、测序,建立菌株的系统发育树进行分析。结果表明,婴幼儿配方奶粉中主要有地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和屎肠球菌(Enterococcus faecium),其中,地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)为优势菌种。说明婴幼儿配方奶粉中存在的微生物主要为芽孢杆菌。     

自然发酵腐与人工接种发酵腐乳的微生物比对研究

目的分析自然发酵腐乳与人工接种发酵腐乳两者微生物种类及可能产生的安全隐患,并对腐乳的生产环节中易产生的杂菌提出改进方案。方法利用传统的微生物分离鉴定方法,依据SB/T 10170-2007行业标准及食品安全国家标准食品微生物学检验等方法对影响腐乳中微生物的几个安全性指标和致病菌进行检测。结果通过2种方式培育的毛霉腐乳,其微生物含量和种类对比性很强,自然发酵腐乳的方式其细菌含量高,致病菌中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌也均有检出,其他致病菌也存在很大的风险。选用人工接种发酵的腐乳其可培养出的微生物种类少,致病菌也未检出。结论选用人工接种发酵的腐乳较自然发酵的腐乳安全性高,更符合市场需求。     

天然发酵茯砖茶微生物菌群及抗菌特性研究

对天然发酵茯砖茶的微生物菌群以及抗菌活性进行研究。微生物分离和鉴定结果表明：曲霉、青霉和散囊菌是天然发酵茯砖茶的主要微生物,其中散囊菌是真菌发酵过程中的优势菌种。发酵茶水提物的抑菌实验显示,茯砖茶的浸提物对一些食品致病菌有抑制作用,尤其是对一些芽孢形成菌如蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、产气荚膜梭菌和生孢梭菌具有抑制作用,抑菌能力随发酵时间的延长而增强。提示在茶叶真菌发酵过程中,能够产生抑制食品致病菌和腐败菌的代谢物质。     

农产品中食源性致病菌的污染状况分析

目的了解农产品中食源性致病菌的污染状况,为政府监管提供依据。方法共抽取430份农产品样品,监测项目为沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7、霍乱弧菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌和诺如病毒。采用全自动基因指纹分析仪对分离到的部分沙门氏菌和金黄色葡萄球菌株进行核糖体基因指纹鉴定。结果农产品中存在食源性致病菌的污染,畜禽产品中检出单核细胞增生李斯特氏菌22株、沙门氏菌17株、金黄色葡萄球菌7株;水产品中检出霍乱弧菌7株;鲜食蔬菜中检出金黄色葡萄球菌11株,72%的金黄色葡萄球菌产肠毒素。全自动基因指纹分析仪的鉴定结果和国标方法完全一致。结论应重视农产品的源头污染,加强监控。全自动基因指纹分析仪可用于食源性致病菌的快速鉴定和溯源。     

基于叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应PMA-qPCR 结合与高温裂解法高通量测序技术检测鉴定检测冷链食品中5多种 病原菌并构建金黄色葡萄球菌分子进化树完成病原菌分子进化树构建与溯源分析

目的 将PMA-qPCR、高通量测序以及分子进化树构建技术相结合,应用于冷链食品中多种病原菌的快速检测、种属鉴定、亲缘关系确定与溯源分析工作。 建立冷链食品中多种病原菌的快速检测技术并完成金黄色葡萄球菌的溯源分子进化分析工作。方法 以冷链食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌等等5种病原菌5种病原菌为作为研究对象, 应用PMA-qPCRPMA-qPCR技术结合高温裂解法作为冷链食品中病原菌检测初筛手段,应用微生物培养法以及生化鉴定仪器法进行方法比对验证qPCR结果,运用高通量测序以及分子进化树构建作为冷链食品中所分离病原菌的种属地位确证方法。研发病原菌活菌快速检测方法并开展冷链食品中病原菌的抽样调查。在建立稳定高效的检测方法后,为了获得冷链食品中病原菌污染水平、分布数据以及污染来源,研究开展冷链食品中病原菌的抽样调查检测工作。在检测出金黄色葡萄球菌等并分离病原菌后,进一步通过多位点采样以及16S rRNA测序构建了葡萄球菌属、弧菌属以及李斯特菌属分子生物进化树,完成菌株种属鉴定采用构建分子进化树的方法以及完成金黄色葡萄球菌等病原菌的溯源分析工作。结果 本研究应用建立的PMA-qPCR成功扩增了冷链食品中生活状态病原菌的特征性核酸片段,排除了死亡细菌以及阴性对照菌的干扰感染,病原菌最低检测浓度可达到1×103 CFU/mL,一次反应可检测42份试样,可以在16小时内完成检测工作。在冷链食品中病原菌抽样检测调查中,本研究共从随机采集的751份冷链食品中检出6162株病原菌,病原菌总体检出率为8.13% (6162/751)。通过后续的16S rRNA测序以及葡萄球菌属、弧菌属以及李斯特菌属分子进化树的构建成功溯源了金黄色葡萄球菌的污染来源并完成病原菌种属定位。通过分子进化树的构建成功溯源了金黄色葡萄菌的污染来源并完成菌种种属定位。本研究还注意到经微生物检验一株疑似单核细胞增生李斯特氏菌阳性菌株,该菌株后续通过测序、序列比对以及分子进化树构建确定为英诺克李斯特菌,这充分说明高通量测序的重要性以及方法验证的必要性。结论 研究在国内率先将PMA-qPCR、高通量测序与分子进化树构建技术相结合,应用于应用本研究方法可以快速有效检测5种冷链食品中的冷链食品中多种病原菌检测分析与种属鉴定,并完成金黄色葡萄球菌的溯源分析,方法特异性好、灵敏度高、检测通量高,研究方法与成果可以为冷链食品及相关食品中病原菌的精确检测与溯源分析提供全新的思路与方法。     

基于微型DNA条形码的多种动物源性成分的鉴定

通过分析51?种动物的DNA条形码序列,新设计一对微型DNA条形码的通用引物,建立一种联合微型DNA条形码和克隆测序法对动物源性多组分样品进行准确、高效鉴定的方法。用微型DNA条形码分别鉴定11?种常见食用肉类,判断其对物种鉴定的准确性,并比较其与标准DNA条形码对物种的鉴定效果,然后将11?种常见商品肉类等比例混合,探究克隆测序法对混合肉样品的鉴定效果。结果表明：引物有较好的通用性,能对具有不同的引物同源性水平的11?个物种进行有效扩增并获单一条带。微型条形码能准确鉴定11?个肉类物种,与常规DNA条形码鉴定效果一致。经克隆测序法,把混合样品的9?个物种一并检出,总体上达到了较高的检出效率,同时深入讨论了未能检出全部物种的原因。微型条形码良好的物种鉴定能力的研究结果为联合微型DNA条形码与二代测序技术进行混合样品中物种的高效鉴定提供参考依据。     

金黄色葡萄球菌定性定量检测中显色培养基的效果评价

目的 评估显色培养基对金黄色葡萄球菌定性定量的检测效果。方法 对金黄色葡萄球菌标准菌株、食品样本分离菌株：30株金黄色葡萄球菌、30株其他葡萄球菌,5株常见食源性致病菌分别用金黄色葡萄球菌显色培养基和Baird-Parker培养基进行培养试验,并用国标法和全自动微生物鉴定药敏分析系统对培养结果进行确证鉴定。结果 试验定性结果显示金黄色葡萄球菌在显色培养基上呈紫红色,30株其他葡萄球菌呈蓝色或乳白色,5株常见食源性致病菌其中单核细胞增生李斯特氏菌呈蓝绿色、表皮葡萄球菌呈乳白色、其余3株不生长,可在直观上对几种食品中常见葡萄球菌进行有效区别,而且目标菌在显色培养基和Baird-Parker培养基上计数值无显著差异(P＞0.05),确证结果显示全自动微生物鉴定药敏分析系统结果与GB 4789.10-2016方法结果一致。结论 显色培养基能快速锁定疑似目标菌落,为溯源调查指明方向,定量计数直观有效,配合全自动微生物鉴定药敏分析系统更提高了对目标菌的鉴定效率,更适用于金黄色葡萄球菌定性定量检测。     

冲调谷物制品污染菌相的调查分析

目的 了解冲调谷物制品中的微生物污染情况及主要污染菌种类,探讨传统形态学鉴定法、分子生物学鉴定法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）鉴定微生物的适用效果。方法 以流通领域抽取的冲调谷物制品为研究对象,采用国家标准方法对其菌落总数和霉菌进行计数,分离纯化不合格产品中的污染菌,以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）结合16S rRNA序列分析方法对污染细菌进行鉴定,以MALDI-TOF-MS方法结合传统形态学鉴定方法对污染霉菌进行鉴定。结果 110批次冲调谷物制品的菌落总数不合格率为3.6%,霉菌计数不合格率为4.5%;分离得到的159株细菌可归于28个种,芽孢杆菌属（Bacillus）细菌为优势菌群,分离频率达到71.7%;分离得到的98株霉菌可划分至25个属,青霉属（Penicillium）和曲霉属（Aspergillus）为优势菌群,分离频率分别为12.4%和7.1%。污染菌中含有克罗诺杆菌（Cronobacter）等条件致病细菌和多种常见产毒真菌,存在一定的食品安全风险。结论 冲调谷物制品的微生物污染情况较为严重,生产企业应重视生产加工过程中的微生物污染问题,相关部门应加强对冲调谷物制品的食品安全监管。MALDI-TOF-MS方法在鉴定细菌时具有较大优势;受限于真菌数据库的不足,其用于食品来源霉菌鉴定的准确率有待提高。     

2015年内蒙古地区31批保健食品中污染菌的分离与鉴定

目的 对保健食品中的污染菌进行分离和鉴定。方法 按照GB 4789《食品安全国家标准 食品微生物学检验》对31批次保健食品进行检验, 采用全自动细菌鉴定系统对污染菌进行鉴定。结果 从31批次的保健食品中分离、鉴定出64株污染菌, 在沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的检验中未检出目的菌, 但分离得到致病菌和条件致病菌, 分别是阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、气味沙雷菌、温和气单胞菌、赫氏埃希菌、阪崎肠杆菌、非脱羧勒菌、泛菌属、缓慢葡萄球菌、浅绿气球菌、哥伦比亚肠球菌、腐生葡萄球菌、产色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、铅黄肠球菌、屎肠球菌、以及枯草/解淀粉/萎缩芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌以及蜡样/苏云金/蕈状芽孢杆菌。结论 各种致病菌及条件致病菌的检出, 对消费者健康存在潜在的风险。通过分析污染菌的来源及危害, 提出提高保健食品卫生质量的建议, 为保健食品的生产、消毒灭菌、卫生学检验及监督管理等方面提供参考。     

4组鱼类DNA条形码引物的筛选与优化

目的通过对DNA条形码氧化酶亚基I基因(cytochrome oxidase subunit I,COI)的4组常用引物进行比较筛选,选择适于舟山鱼类鉴定的最佳引物。方法以舟山主产大黄鱼、小黄鱼、带鱼和乌贼样品DNA为模板,对4组常用DNA条形码引物进行PCR体系优化。通过比较PCR产物量、特异性、灵敏度和测序成功率,综合分析筛选最佳引物组。结果 4组引物均能扩增大黄鱼、小黄鱼和带鱼的DNA,对于乌贼DNA的扩增具有明显差异。COI优化引物具有易于扩增、测序简单等优势,更适于作为海产品鉴定的DNA条形码引物。结论本研究为舟山海产品的市场监管和实验室大量样品检测提供了技术参考。     

感官异常番茄酱和杏酱中腐败细菌的快速鉴定

目的采用微生物快速质谱鉴定法快速鉴定新疆感官异常番茄酱和杏酱中的细菌。方法对感官异常番茄酱和杏酱中的细菌进行分离培养获得9株细菌菌株,运用Vitek MS微生物快速质谱鉴定仪对分离的细菌菌株进行鉴定,同时采用VITEK2微生物鉴定仪鉴定菌株。结果番茄酱中获得的5株菌分别为:解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沃氏葡萄球菌、粪肠球菌;杏酱中获得的4株菌分别为巴氏葡萄球菌、粪肠球菌、沃氏葡萄球菌、浸麻类芽孢杆菌。结论本研究快速鉴定结果与化学鉴定结果基本一致。