食品中大肠杆菌O157∶H7疑似菌株的分离和鉴定研究

采集117份食品样品,经过PCR扩增毒力基因stx1、stx2和O157特征基因rfbO157初筛。将部分PCR阳性的食品样品,经过新生霉素EC增菌液增菌、免疫磁珠富集、血清学鉴定、菌落PCR复筛,分离出5株O157:H7疑似菌株。其中1株O157∶H7疑似菌株EC5.11不能与O157诊断血清产生良好凝集反应,采用血清学方法该菌容易漏筛。采用PCR扩增rfbO157基因和H7鞭毛抗原编码基因fliCH7,EC5.11均呈阳性反应。最终包括EC5.11在内的4株疑似菌株被证实为O157∶H7血清型。本研究提出了一种改良方法筛选、鉴定食品中O157∶H7疑似菌株,比起传统方法,减少工作量的同时提高了筛选的特异性。     

大肠杆菌O157:H7胶体金试纸条的研制

采用胶体金标记抗大肠杆菌O157:H7 单克隆抗体(鼠源),通过将大肠杆菌O157:H7 多克隆抗体和驴抗鼠抗体(二抗)喷涂于硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线,研制大肠杆菌O157:H7 胶体金快速检测试纸条。通过优化实验,确定最佳条件为标记量16.8μg/mL、标记pH8.0、封闭剂PEG20000、检测时样品最佳pH7.0～7.5。对26 株常见细菌交叉反应结果表明,该试纸条除与鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311 和金黄色葡萄球菌CMCC 26003 有轻微交叉反应外,与其他24 株菌均无交叉反应。该试纸条灵敏度为104CFU/mL。用该试纸条检测大肠杆菌O157:H7操作简便、快捷、灵敏度高、特异性强。     

使用环介导等温扩增技术快速检测食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的初步研究

目的探索建立一种快速、简单的食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的检测方法。方法针对编码O157∶H7脂多糖的rfbE基因(GenBank S83460)和编码H7鞭毛抗原的fliC基因(GenBank L07388)特征性保守序列,利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)核酸扩增基因技术,对21株O157∶H7和非O157∶H7菌株进行特异性检测,并与聚合酶链式反应方法进行比较。同时使用部分食品样品对LAMP法检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的实际运用价值进行评估。结果LAMP法可以在1h内完成检测工作。LAMP法检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的灵敏度为96.72%,特异度为85.71%,准确性为93.26%。结论LAMP检测技术的灵敏度较聚合酶链式反应技术高。LAMP是一种简单、快速的检测技术,适用于筛选可疑大肠杆菌O157∶H7样本。     

DNA探针法检测水牛乳及其制品中大肠杆菌O157:H7的研究

以大肠杆菌O157:H7的志贺氏氏毒素Stx I基因保守序列设计特异性引物,并进行PCR扩增,采用地高辛标记扩增的DNA片段以制备探针。用DNA探针对纯菌种大肠杆菌O157:H7和对照组菌株进行斑点杂交检测,结果表明:大肠杆菌O157:H7的Stx I基因探针对纯菌种大肠杆菌O157:H7DNA产生较强的阳性反应,而与福氏志贺氏氏菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特氏菌、大肠埃希氏菌和伤寒沙门氏菌DNA等均无反应,表明该Stx I的DNA探针特异性较强。用该探针对人工污染水牛乳进行检测,成功检出大肠杆菌O157:H7,最低检出限为8.58×102 cfu/m L,可应用于水牛乳中大肠杆菌O157:H7的快速检测。     

大肠杆菌O157:H7与假单胞菌混合菌膜形成时交互作用及其对毒力基因表达的影响

以大肠杆菌O157:H7和食品中常见腐败菌假单胞菌为对象,研究两种菌混合培养时菌体泳动能力和混合菌膜形成时的交互作用,进一步采用反转录实时定量聚合酶链式反应分析大肠杆菌O157:H7代表菌株在混合菌膜形成时毒力基因（stx1、stx2、hly和eae）表达变化。菌体泳动性结果显示,3 株大肠杆菌O157:H7泳动性均低于4 株假单胞菌（P＜0.05）,两种菌混合培养时假单胞菌的泳动能力受到显著抑制。选择性培养计数发现混合菌膜形成72 h时,两种菌未发生相互促进,其中4 株假单胞菌的菌膜形成均受到3 株大肠杆菌O157:H7显著抑制（P＜0.05）。选取大肠杆菌O157:H7 CICC21530菌株分析毒力基因表达,结果发现混合菌液单位体积、混合菌膜单位面积4 种毒力基因表达分别低于单种菌液、单种菌膜（P＜0.05）,进一步的单位菌数结果亦然,表明混合培养和混合菌膜形成时假单胞菌抑制了大肠杆菌O157:H7毒力基因表达;单位菌数结果还发现菌膜中4 种毒力基因表达均高于浮游菌（P＜0.05）,表明形成菌膜后菌体毒力增强。本研究可为揭示食源性致病菌和腐败菌混合菌膜形成的交互作用及进一步风险评估和风险防控提供科学依据。     

基于实时荧光环介导等温扩增快速检测鸡肉中的大肠杆菌O157:H

以大肠杆菌O157:H7的VT2基因序列设计特异性引物,利用Midori Green新型核酸荧光染料,建立鸡肉中大肠杆菌O157:H7实时荧光定量环介导等温扩增(Rti-LAMP)检测方法。纯培养大肠杆菌O157:H7检测灵敏度达3.5 CFU/反应,需时45 min。模拟大肠杆菌O157:H7污染鸡肉样品,经37℃增菌4 h,用Whirl-pak无菌袋过滤离心得沉淀,提取样品DNA模板用于Rti-LAMP反应,检测大肠杆菌O157:H7灵敏度达140 CFU/g,整个检测流程约7 h。采用蒙脱石封闭的活性炭前处理污染鸡肉样品,不经增菌过程,结果表明:该Rti-LAMP检测方法灵敏度达12 CFU/g,整个检测耗时约4.5 h。市购鸡肉样品51份,以大肠杆菌国标检测法为对照,研究基于Rti-LAMP联合增菌或封闭活性炭预处理而不经增菌的两种方法,对比检测临床鸡肉样品大肠杆菌O157:H7污染率。结果:国标法和增菌的Rti-LAMP两种方法均检测到同一鸡肉样品为大肠杆菌O157:H7阳性,经封闭活性炭预处理而未经增菌的Rti-LAMP则检测到8份鸡肉样品大肠杆菌O157:H7阳性。研究表明,封闭活性炭预处理的Rti-LAMP检测方法较国标法更灵敏、快速、简便、特异地检测鸡肉中大肠杆菌O157:H7污染。     

温度生长预测模型在大肠杆菌O157:H7控制中的应用

大肠杆菌O157:H7是严重危害人类健康的肠道致病菌。本实验研究了该菌在温度、pH、NaCl浓度影响下的生长繁殖规律,确定了大肠杆菌O157:H7的最适生长条件。建立了在pH、NaCl浓度最佳情况下鸡肉和肉汤中该菌的温度生长预测模型。以模型为依据,提出了出口分割鸡肉中控制大肠杆菌O157:H7的措施。     

食品中大肠杆菌O157的PCR检测与wzy基因的测序分析

大肠杆菌O157:H7 和O157:H- 是重要食品致病菌。从食品中分离得到一株O157:H7 菌株EC5。将该菌株PCR 扩增wzy 基因全长并克隆测序。结果表明,wzy 基因序列与大肠杆菌O157:H7 标准株EDL933 有100% 同源性。从NCBI GenBank 数据库下载O157 菌株wzy 基因序列,针对保守序列设计引物并扩增O157 菌株和非O157 菌株。PCR 结果表明,wzy 基因特异性强,可作为检测O157 菌株的标志基因。本研究为开发大肠杆菌O157 的分子检测技术提供新的研究思路。     

大肠杆菌O157:H7快速增菌培养基检测效果的研究

为了验证对于大肠杆菌O157:H7菌株特异性、复苏效果以及快速生长的特点,比较了3种培养基对于大肠杆菌O157:H7的增菌效果。研究结果表明,8h培养时间内,MicroFast~?快速增菌培养基对于冷损伤和热损伤的大肠杆菌O157:H7菌株具有良好的修复和增殖效果。MicroFast~?快速增菌培养基营养组分适合O157菌株的生长需求,在MicroFast~?快速增菌培养基中,大肠杆菌O157:H7菌株的倍增时间为13.5min,远高于m EC+n的28min,且MicroFast~?快速增菌培养基能够完全抑制部分G+细菌以及部分G-细菌的干扰,对于大肠杆菌O157:H7具有特异性的选择。故MicroFast~?快速增菌培养基对于大肠杆菌O157:H7菌株具有良好的选择特异性,能够短时间内(8h内)有效富集培养大肠杆菌O157:H7菌株,是一种能够实现大肠杆菌O157:H7菌株快速高效、特异增殖的培养基,将其结合检测金标卡,能够实现8h内快速检测,结果可信可靠。     

出血性大肠杆菌O157:H7国内分离株耐酸性的研究

EHEC O157：H7难以控制的原因之一是该菌对酸的耐受性。将国内6株EHEC O157：H7在不同pH的LB溶液中振荡培养，每隔1h计数，实验结果表明了6株菌耐受时间相比较存在差异，菌株97063较其它菌株在pH2．5条件下，耐受时间长超过了29h。本实验旨在对EHEC O157：H7的国内分离株耐酸性进行研究，为控制EHEC O157：H7的感染提供科学依据。检验检疫部门、食品卫生部门等应高度重视对酸性食品中大肠杆菌O157：H7的检验。     

改良热酚水法制备大肠杆菌O157∶H7脂多糖抗原的研究

采用热酚水法提取肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157∶H7的脂多糖（LPS）,经浓缩酶解,离心分离得纯化LPS,酸解制得O-特异性侧链（O-PS）,能有效去除核酸及杂蛋白,抗原具有鲎试剂凝集活性及对产蛋鸡有较强的免疫原性,建立了一种改良热酚水法提取制备O157∶H7特异性脂多糖抗原的方法.     

温州市食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7污染状况调查

目的调查温州市食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的污染状况,了解肠出血性大肠杆菌O157∶H7毒力因子的携带与耐药情况。方法采用分层随机抽样的方法,对2008—2011年抽取的231份食品样品,用免疫磁珠富集法对大肠杆菌O157∶H7进行分离,对该分离株进行生化、血清学鉴定,以纸片法(K-B法)进行药敏试验;采用PCR方法检测O、H抗原基因和stx1、stx2、eaeA、hlyA等4种毒力基因。结果 231份样品中,分离出1株肠出血性大肠杆菌O157∶H7,检出率为0.43%;O157抗原和H7抗原的核酸检测结果阳性,但未检测到stx1、stx2、eaeA、hlyA等4种毒力基因,菌株对红霉素、利福平、150μg/片和10μg/片两种浓度的0/129(二氨基二异丙基喋啶磷酸盐)耐药。结论温州市食品中存在大肠杆菌O157∶H7的污染,检出率较低,但提示要加强主动监测,通过有效干预,防范肠出血性大肠杆菌O157∶H7所致食源性疾病的发生。     

一株肠出血性大肠杆菌O157H7免疫奶牛实验即抗EHEC O157H7免疫乳的试制

用1株O157H7菌株和另外11株人类肠道主要病原细菌配制O157H7单菌疫苗和多菌联合多价疫苗,对荷斯坦牛进行免疫实验。对免疫常乳中抗EHEC O157H7特异性抗体凝集价进行了长期监测,并对受试奶牛的免疫反应、应激反应及疫苗对奶牛可能产生的毒性作用进行了观察。结果证明,疫苗免疫效果很好,所有奶牛在整个泌乳期一直保持较高的特异性抗体效价(滴度),均在27以上,下个泌乳期开始阶段也未见明显下降的迹象。本次实验意外发现约有30%的未进行过免疫注射的对照组乳样有较高的O157H7特异性抗体滴度,个别乳样凝集价高达27,这可能说明这些牛群中有较高的O157H7感染率或携带率。O157H7是人类近二十余年来才开始认识到的出血性结肠炎(HC)的主要致病菌,能造成出血性腹泻和其它严重并发症。是值得研究和重点防范的病原细菌。     

可视化-环介导等温扩增技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H7

目的 建立可视化的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)联合横向流动试纸条(lateral flow dipstick, LFD)方法检测肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)O157:H7的分析方法。方法 以EHEC O157:H7的遗传标志性基因z3276基因序列为检测靶标设计6条LAMP特异性引物, 其中2条环引物分别标记异硫氰酸荧光素和地高辛, 用LFD检测扩增产物, 建立EHEC O157:H7 LAMP-LFD检测方法。结果 所建立的检测方法能够特异性的检测EHEC O157:H7, 与试验对照菌株EHEC O26、O145、O45、O121, 及其他主要大肠杆菌血清型O25、O78、O103、O111、O127、O138、O139、O141, 及禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)E058、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)SEC627、EPEC SEC689、K12-MG1655、BL21, 和其他种属的受试菌, 不存在交叉反应; 对EHEC O157:H7纯培养物的最低检测限为1.3 CFU/mL。结论 本研究所建立的LAMP-LFD检测方法特异性和敏感性良好, 操作简单, 结果可视。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7的分子生物学检测及PCR检测

大肠杆菌一些特殊的血清型具有致病性,肠出血性大肠杆菌是大肠杆菌的一个亚型,主要致病菌株为O157:H7,可引起感染性腹泻,因能引起人类的出血性肠炎而得名。本文综述了分子生物学检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的研究进展。分子生物学检测是利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质的分析方法,主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体免疫金层析法以及免疫磁珠分离法(IMS)。PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H7,主要包括常规PCR检测、多重PCR检测以及实时荧光定量PCR检测。这两种方法灵敏度高、特异性强、操作简便、结果准确等优点,是检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的常用方法。     

应用DPO-PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7

利用双启动寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide,DPO）聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7。根据DPO引物设计原则,以肠出血性大肠杆菌O157∶H7 rfbE 基因为靶基因设计一对DPO引物,经过反应体系的优化,建立了肠出血性大肠杆菌O157∶H7 DPO-PCR检测方法, 其检测灵敏度约为94 CFU/mL。与常规PCR方法相比,所建立的DPO-PCR方法对退火温度不敏感,在引物设计和实 验过程中不需要对引物及其退火温度反复优化,同时基于DPO引物的特殊结构又增强了其特异性。DPO-PCR方法 设计简易、特异性强,为致病性微生物的快速准确检测提供了新途径。     

IMSA技术快速检测肠出血大肠杆菌O157:H7方法的建立及应用

为了建立和评价一种适合食药监及基层检验部门使用的肠出血性大肠杆菌O157:H7快速检测方法,针对肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性rfbE 基因,应用等温多自配引发扩增技术（Isothermal Multiple Self-matching-initiated Amplification,IMSA）,设计引物进行检测。对建立的方法进行特异性试验和灵敏度试验,与荧光定量PCR法进行比对;利用建立的IMSA法确定人工污染样本被检出的最短增菌时间和最低检测灵敏度;使用IMSA法和国标法对24份不同肉制品进行检验,评估两者的一致性。结果表明:该方法仅对肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性扩增;IMSA法的灵敏度比qPCR法高,达8.9×102 CFU/mL;人工污染菌种样本最短增菌10 h可以被建立的IMSA法检出,检出限为9.1 CFU/25 g;24份肉制品样本的IMSA法与常规培养法结果一致性为100%。结论: IMSA技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H7具有特异性强、灵敏度高、结果快速准确的特点,可在11 h内完成食品中O157:H7的检出,适用于食药监及基层检验部门进行肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测。     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7基因组和质粒pO157致病因子

为推动O15 7:H7致病机制的深入研究 ,介绍了近年来对EHECO15 7:H7的基因组和特异性大质粒pO15 7上与细菌致病性有关的主要致病因子的研究进展。     

Incidence of Escherichia coli O157:H7 and E. coli virulence factors in US bulk tank milk as determined by polymerase chain reaction

Samples of bulk tank milk from dairies across the United States, taken as part of the National Animal Health Monitoring Dairy 2002 survey, were analyzed for the presence of several genes encoding virulence factors associated with enterohemorrhagic forms of Escherichia coli (EHEC) using real-time and conventional PCR assays. Samples from 859 farms in 21 states were collected and enriched in EC medium at 42.5°C to amplify any E. coli present, and DNA was isolated from the resulting biomass. The eaeA gene encoding intimin, a virulence factor associated with enteropathogenic forms of E. coli and EHEC, was detected in 199 (23%) of the samples. Thirty-six samples (4.2%) were positive for eaeA, the gamma allele of the translocated intimin receptor (γ-tir), found in EHEC strains of O157:H7, and one or both shiga-like toxin genes (stx1 and stx2), a combination that may be indicative of the presence of O157:H7 EHEC. Testing these 36 samples with a commercially available real-time PCR kit for detection of O157:H7 indicated that 5 samples could be contaminated with O157:H7. A multiplex PCR to detect the presence of fliC, rfbE, and hlyA genes found in O157:H7 reduced to 2 (0.2% of all samples) the number of samples likely to be contaminated with this organism. A strain of O157:H7 (eaeA⁺, γ-tir⁺, stx2⁺, rfbE⁺, fliC⁺, hlyA⁺) was subsequently isolated from one sample. Thirty-four eaeA-positive samples did not contain detectable γ-tir but did contain one or both of the stx genes suggesting the presence of EHEC strains other than O157:H7. These results indicate a low incidence of O157:H7 in bulk tank milk but suggest that a risk from other enteropathogenic and EHEC forms of E. coli may exist and that PCR targeting virulence factors associated with highly pathogenic forms of E. coli may be an effective means of detecting potential dangers in raw milk.