重组人凝血酶真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的稳定表达

目的 构建含重组人凝血酶基因的重组真核表达载体,并转染哺乳动物细胞CHO,建立稳定表达重组人凝血酶的细胞株.方法 利用限制性内切酶EcoR I和XbaI将凝血酶基因插入真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,构建含人凝血酶基因的重组质粒pcDNA3.1 （＋）/thrombin,利用双酶切和测序法鉴定.采用阳离子脂质体介导方法,将构建的表达载体转染到CHO细胞中,通过G418加压筛选出阳性细胞克隆,建立稳定表达人凝血酶的细胞株,并扩大培养.采用RT-PCR和SDS-PAGE法检测其mRNA和蛋白质的表达,并对其生物活性进行鉴定.结果 重组质粒pcDNA3.1 （＋）/thrombin经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误;经RT-PCR和SDS-PAGE法鉴定,转染的CHO细胞可表达、分泌人凝血酶,得到的重组人凝血酶表观相对分子质量（Mr）为43000左右,与预测一致,且具有降解并凝固牛纤维蛋白原的活性,其比活为234.1 U/mg.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 （＋）/thrombin,并成功地在CHO细胞中表达了具有生物活性的重组人凝血酶,该体系的建立为进一步规模化生产重组人凝血酶奠定了基础.     

重组融合人血清白蛋白-人白介素-2 C125A突变体在毕赤酵母中的表达

构建编码人血清白蛋白-人白介素-2 C125A的重组表达质粒,在Pichia pastoris GS115中表达,获得具有较高IL-2活性的融合蛋白.设计并合成符合P. pastoris密码子偏好,且含有C125A突变的IL-2编码基因IL-2m,通过酶切连接方法将其与人血清白蛋白(HSA)的编码基因连接为融合蛋白HSA-IL2m的编码基因.克隆到表达质粒pPIC9K中,电击转化P. pastoris GS115感受态细胞,获得重组P. pastoris GS115/pPHIm基因工程菌.摇瓶发酵获得分泌表达产物.结果: Western blot鉴定结果显示该融合蛋白与IL-2、HSA的抗体都能发生免疫反应.经脱盐、冻干制备的粗蛋白的IL-2生物学活性为1.51×106 IU/mg.结论:在P. pastoris GS115中成功表达了具有人白介素-2生物学活性的HSA-IL2m融合蛋白.     

Mincle受体蛋白克隆、原核表达与纯化

本研究通过应用基因工程技术,构建融合基因pET14b-Mincle的原核表达载体,并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白Mincle,并对其表达产物进行纯化、鉴定、透析复性。采用RT-PCR技术扩增小鼠Mincle的基因片段,将其克隆于载体pMD18-T中,并克隆到带有His-tag的原核表达载体pET14b中;重组质粒经酶切鉴定、序列比对验证正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达目的蛋白。经1mmol/LIPTG在37℃下诱导5h获得了分子量约为22kDa的重组融合蛋白的优化表达,SDS-PAGE、Western Blot和ELISA证实了重组蛋白的特异性。Mincle以包涵体形式在宿主中表达,利用Ni2+亲和柱进行纯化和生物膜透析复性,纯化和透析后的蛋白经WesternBlot、ELISA法定性鉴别以及用白色念珠菌(SC5314)整个灭活细胞对复性后蛋白的活性测定,透析后的Mincle重组融合蛋白能与白色念珠菌的特异性结合体现其生物活性,表明获得了具有活性的蛋白,为后续研究打下基础。     

藤黄微球菌过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的重组与表达

目的应用基因重组技术在大肠杆菌中高效表达藤黄微球菌过氧化氢酶(catalase,CAT)。方法从藤黄微球菌DNA中获得CAT编码基因,并应用pProEx-HTa质粒构建融合表达载体并表达和检测活性。结果通过融合表达获得可溶性带6×His标签重组蛋白,该蛋白经过Ni-NTA纯化后可获得活性物质。结论从大肠杆菌表达体系中表达了具有生物活性的CAT。     

重组牛乳铁素融合表达质粒的构建及其抑菌活性分析

为建立生物合成牛乳铁素的方法,根据牛乳铁素氨基酸序列确定其编码序列,利用PCR 技术获得基因扩增产物,接着将该产物与编码鱼腥蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120 的DNA 聚合酶基因dnaENI 中断裂的内含肽基因Asp dnaEIn 的PCR 产物进行重组PCR,将获得的重组融合基因再克隆到表达载体pET-28a 构建重组融合表达质粒。结果显示,融合表达质粒转化大肠杆菌后经诱导能在大肠杆菌表达宿主Escherichia.coli BL21(DE3) 中大量表达,且细胞裂解液与纯化的Anabaena sp. PCC 7120中含断裂内含肽Asp DnaEIc的DNA聚合酶蛋白DnaECI混合反应后对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。     

藤黄微球菌过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的重组与表达

目的应用基因重组技术在大肠杆菌中高效表达藤黄微球菌过氧化氢酶（catalase,CAT）。方法从藤黄微球菌DNA中获得CAT编码基因,并应用pProEx．HTa质粒构建融合表达载体并表达和检测活性。结果通过融合表达获得可溶性带6×His标签重组蛋白,该蛋白经过Ni-NTA纯化后可获得活性物质。结论从大肠杆菌表达体系中表达了具有生物活性的CAT。     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中的可溶性表达及分离纯化研究

根据NCBI中的人胰岛素原基因序列及大肠杆菌密码子偏爱性设计特异引物,PCR扩增得到人胰岛素原基因,构建该基因的原核表达质粒p ET32-PI,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。对重组菌进行温度和IPTG浓度优化,发现重组菌在30℃和终浓度为0.6 mmol/L的IPTG条件下表达效果最好且没有包涵体,经SDS-PAGE和Westem blot检测,表达蛋白的相对分子质量与理论相对分子质量一致且具有胰岛素的免疫原性,证明胰岛素原基因得到了正确表达。对重组菌进行流加发酵,发酵液离心收集菌体,破菌后上清液过亲和层析柱和离子交换柱分离纯化目的蛋白,透析后的样品用肠激酶和羧肽酶酶切,利用亲和柱去除融合蛋白与His标签,最终分离胰岛素样品,利用免疫酶标法,l m L样品测得活性92μIU,证明实验所得样品具有人胰岛素活性。     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法PCR扩增出apoptin序列,与表达载体EC-SOD3-pET-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MTT活性检测。结果表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性。结论成功构建了表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

人β-防御素3基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

以质粒pPIC9K．hBD3为模板,扩增得到一段上游带信号肽因子（a-factor）的人3-防御素-3（hBD-3）基因,克隆至酿酒酵母穿梭质粒pYES2中,构建了酿酒酵母表达载体pYES2．a-factor-hBD3（pYa-hBD3）。将重组质粒转化至SaccharomycescerevisiaeINVSCl中,鉴定阳性重组子,经2％半乳糖诱导表达。实验发现表达所得hBD-3对金黄色葡萄球菌（ATCC6538）和大肠杆菌（ATCC10231）具有明显的抑菌活性。hBD-3基因片段在酿酒酵母中的表达,为进一步探讨hBD-3的生物活性及防御素应用安全性打下基础。     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的 克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性.方法 PCR扩增出apopfin序列,与表达载体EC-SOD3-Pet-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MIT活性检测.结果 表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E. Coli BL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性.结论 成功构建了表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apopfin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力.