伏马菌素B1人工抗原的制备及其鉴定

本试验采用戊二醛一步法将小分子半抗原(伏马菌素B1,FB1)与载体蛋白OVA进行偶联,制备人工抗原FB1-OVA。分别采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、紫外扫描法(UV)、质谱法(MS)和免疫芯片法来检测FB1与OVA的偶联效果。结果证明,成功得到了人工抗原FB1-OVA,而且通过质谱法检测得出FB1-OVA和OVA的分子量分别是51928.612和44265.718,分析其偶联比为10.6:1。     

两种方法制备氟苯尼考人工抗原及其鉴定

目的：通过两种不同方法制备氟苯尼考人工抗原并将制备的人工免疫原用于动物免疫。方法：分别采用琥珀酸酐法和强碱水解法制备两种人工半抗原(HP1 和HP2)。将两种半抗原与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)通过活泼酯法和戊二醛法进行偶联,制备人工免疫原和人工包被原,分别命名为HP1-BSA、HP1-OVA、HP2-BSA 和HP2-OVA。分别将两种方法合成的人工免疫原用于动物免疫,用两种人工包被原对获得的两种抗血清进行评价。结果：经质谱、紫外光谱表征,氟苯尼考两种半抗原均合成成功,并且与载体蛋白的偶联比分别为12.4:1(HP1-BSA)、8.5:1(HP1-OVA)、21.8:1(HP2-BSA)、15.4:1(HP2-OVA)。动物实验结果表明,获得的针对HP1-BSA的抗血清与HP2-OVA 包被原结合最为灵敏。结论：活泼酯法和戊二醛法均成功制备了氟苯尼考人工抗原。     

丁香酚半抗原及人工抗原的合成与鉴定

目的 合成丁香酚半抗原及人工抗原并对其结构进行鉴定。方法 采用氯乙酸对丁香酚进行结构改造, 以获得含羧基的丁香酚半抗原。将经重结晶纯化后的半抗原与牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)经碳化二亚胺(carbide dimethylamine, EDC)偶联制备人工抗原。采用电喷雾串联三重四极杆质谱法对丁香酚半抗原的结构进行鉴定。采用紫外光谱及基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization-flight time mass spectrometry, MALDI-TOF MS)对偶联物的结构进行鉴定。结果 紫外光谱结果表明, 与载体蛋白相比, 偶联物的特征吸收峰强度有一定的增强; MALDI-TOF MS结果表明, 表明丁香酚半抗原与BSA的偶联比为12.5:1。结论 本研究成功建立了丁香酚半抗原及人工抗原的制备方法, 为丁香酚抗体的制备提供了前期研究基础。     

纺织品中白假丝酵母菌的检测方法研究

探讨采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法检测纺织品中白假丝酵母菌的效果。对纺织品进行白假丝酵母菌检测,在传统培养基础上,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术代替传统生化鉴定,建立纺织品中白假丝酵母菌高效快速检测方法。通过对人工污染纺织品的检测表明:细菌回收率在74.7%~96.7%,标准曲线相关系数为0.967 9,技术指标符合微生物定量检测要求;而由不同人员、不同批次试剂、不同地点检测得到的结果差异并不显著。认为:基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法准确性、复现性、稳定性都很好,适合实验室检测纺织品中白假丝酵母菌。     

盐酸西布曲明人工抗原的合成与鉴定

目的：建立盐酸西布曲明的免疫分析方法。方法：4-氯苯乙腈和1, 3-二溴丙烷为原料合成与盐酸西布曲明具有相同母核结构的小分子双去甲基西布曲明(M2),以双去甲基西布曲明为半抗原,并分别通过活泼酯法、戊二醛法和混合酸酐法将半抗原与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫原(M2-BSA)和包被抗原(M2-OVA)。结果：紫外光谱扫描证明半抗原M2与载体蛋白偶联比为24.6:1(M2-BSA)和16.2:1(M2-OVA),抗血清ELISA效价均达到1:8000以上,IC50=0.42μg/mL。结论：半抗原M2与载体蛋白均已成功偶联,其中活泼酯法对半抗原活性基团的影响最小,合成人工抗原的特异性最强。     

泰拉霉素完全抗原的合成和鉴定

利用丁二酸酐法对泰拉霉素的羟基衍生化,引入游离羧基,合成泰拉霉素半抗原。采用活泼酯法将泰拉霉素半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)偶联,合成人工完全抗原泰拉霉素-BSA和泰拉霉素-OVA。利用LC-MS鉴定衍生化后半抗原的合成,利用荧光光谱、考马斯亮法鉴定完全抗原的合成。用泰拉霉素-BSA免疫小鼠,采用间接ELISA法测定小鼠抗血清效价。泰拉霉素半抗原和BSA的偶联比为17∶1。三免后小鼠抗血清效价可达1∶8 000。     

两种特异性氰戊菊酯人工抗原的合成与鉴定

选择化学结构具有典型研究意义的氰戊菊酯(fenvalerate,Fen)为研究对象,利用有机化学合成法在氰戊菊酯分子的一端分别引入两种不同连接长度的连接臂。通过核磁共振(1H-NMR)、液相色谱-质谱联用仪(LC-MS-MS)鉴定,成功合成两种半抗原Fen1和Fen2,并与牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)偶联合成了两种氰戊菊酯免疫特异性人工抗原Fen1-BSA、Fen2-BSA,经紫外分光光度仪扫描,人工抗原的紫外图谱相对于半抗原和载体蛋白有明显差异,测得偶联比分别约为9:1和10:1,经SDS-PAGE电泳检测表明偶联成功。     

3种方法鉴定鸡肉粉中沙门氏菌的比对研究

目的采用3种方法对鸡肉粉中沙门氏菌进行检测。方法3份样品的前处理依据组织方提供的《作业指导书》进行,每瓶样品直接加入4.5 mL灭菌去离子水复溶,作为初始样本,后续实验依据GB4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》操作。鉴定分离出疑似菌后,加入了实时荧光定量PCR法、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法2种方法作为辅助检测,并用全自动微生物鉴定系统进行生化鉴定,再结合生化鉴定与血清学实验综合评判检测结果。结果使用3种鉴定方法在JS015、JS110、JS140样本中均检出沙门氏菌。结论本研究采用的实时荧光定量PCR法、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法2种方法均能快速准确鉴定出沙门菌,特别是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法和血清学分型配合使用,对沙门菌的快速鉴定有重要意义。     

黄曲霉毒素G1人工抗原的合成

以间氯过氧苯甲酸(m-chloroperbenzoie acid,MCPBA)为氧化剂,使黄曲霉毒素G1(Aflatoxin G1,AFG1)转化为其8,9.环氧化物,与牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)在两相反应体系中实现偶联,得到复合物AFG1-BSA.复合物紫外扫描结果显示其扫描图谱与BSA和黄曲霉毒素G1的图谱有明显差异,同时复合物与BSA荧光强度的差异,这表明BSA与黄曲霉毒素G1偶联.AFG1-BSA中AFGl与BSA的摩尔比为4.29:1.以合成人工抗原免疫小鼠,制备了特异性的鼠抗AFG1多克隆抗血清.用间接ELISA法测得抗体血清的最高效价可达1:16000,并测定了抗体的敏感度以及特异性.     

甲胺磷人工抗原的合成与鉴定

采用重氮法直接用甲胺磷连接牛血清白蛋白合成了人工抗原。通过鉴定,该人工抗原的紫外吸收光谱呈现出与半抗原、载体蛋白的紫外吸收光谱均不同的吸收峰;红外光谱图中也同时呈现了半抗原与载体蛋白的特征吸收带;并测得人工抗原中甲胺磷与载体蛋白的结合比为15∶1,表明该人工抗原合成成功。     

链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸人工抗原的合成及其多克隆抗体制备

本研究采用肟化法用羧甲基羟胺半盐酸盐对链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸(Tenuaconic acid,TA)进行衍生后引入连接臂,得到了半抗原TAO。通过活性酯法将半抗原TAO分别与牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)偶联制备得到免疫原TAO-BSA、与血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)偶联制备得到包被原TAO-KLH。经透析纯化后分别采用紫外光谱、红外光谱扫描法对合成的人工抗原进行初步鉴定,制备得到的人工抗原的偶联比分别为18.3:1、38.7:1。此人工抗原免疫Balb/c小鼠后获得的鼠源抗血清进一步验证了人工抗原合成成功,制备得到特异性识别TA的多克隆抗体。通过ELISA棋盘法确定了最佳包被原浓度以及最佳抗体稀释度并建立了TA间接竞争ELISA检测方法,其灵敏度以半抑制浓度IC50表示为335.55 ng/m L,最低检出限(LOD)为19.00 ng/m L,定量线性检测范围为200.00~1563.00 ng/m L。     

氯霉素免疫抗原及包被抗原的制备

采用混合酸酐法合成30:1～10:1 三个不同起始物质的量比的氯霉素免疫抗原(HAP-KLH),采用活泼酯法(EDC-NHS)合成40:1～1:1 七个不同起始物质的量比的包被抗原(HAP-OVA),紫外测定HAP-KLH 偶联比25:1～8:1,HAP-OVA 偶联比23:1～1:3。间接竞争ELISA 实验优化包被抗原,在23:1～3:1 偶联比范围内,氯霉素(CAP) IC50值为36～15ng/mL,随着偶联比的减小而降低,当偶联比低于3:1 则略为上升。确定了包被抗原HAP-OVA 最佳偶联比为3:1。本研究表明包被抗原的偶联比对ELISA 测定IC50 值有重要影响,应合成不同偶联比的包被抗原,选出最佳偶联比。     

罗丹明123人工抗原的合成及抗体的酶联免疫检测

为建立罗丹明B(rhodamine B)的免疫分析方法,采用戊二醛法,将半抗原罗丹明123与载体牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原R123-B S A和包被抗原R123-OVA。经动物免疫实验证实人工抗原合成,并制备抗罗丹明123的多克隆抗体,此抗体同时能够检测食品中的罗丹明B,且最低检测限为0.001ng/mL。     

多效唑人工抗原的合成与鉴定

为合成新的、有效的多效唑人工抗原,采用琥珀酸酐法对多效唑小分子进行结构修饰,以获得含羧基的多效唑半抗原。将纯化后的半抗原分别与牛血清白蛋白和卵清蛋白经N-羟基琥珀酰亚胺活泼酯法偶联制备免疫原和包被原。采用质谱、红外光谱、核磁共振氢谱对多效唑半抗原的结构进行鉴定;采用紫外光谱及高性能基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱对偶联物的结构进行鉴定。结果显示成功合成出多效唑人工抗原,为其抗体的制备和免疫学方法的构建奠定了前期研究基础。     

杀菌剂抑霉唑人工抗原的合成和鉴定

以咪唑乙醇为原料,与6- 溴己酸乙酯发生取代反应后再经水解反应合成抑霉唑半抗原(6-[1-(2,4- 二氯苯基)-2-(1- 咪唑基)乙氧基]己酸)。产物经薄层层析和1H-NMR 鉴定后,采用活化酯法分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联得到免疫原(HIA-BSA)和包被原(HIA-OVA),紫外光谱分析法计算得其偶联比分别为13:1 和7:1,初步说明人工抗原合成成功。通过免疫动物获得效价为1:64000 的抗体,采用间接竞争ELISA 法测定抗体的IC50 值为1.76μg/mL,从而进一步证明人工抗原合成成功,所得的抗体可用于ELISA 检测试剂盒的研制。     

抗AFB_1单域重链抗体文库淘选方法的研究

比较两种从噬菌体展示文库中淘选抗黄曲霉毒素B1单域重链抗体的方法,并为淘选针对小分子物质的单域重链抗体提供参考.采用固相淘选技术,以黄曲霉毒素B1人工抗原为靶分子,淘选天然单域重链抗体库,分别采用Gly-HCl法和AFB1竞争法洗脱结合噬菌体,对洗脱物进行滴度测定,以回收率和富集度为指标,对两种洗脱方法进行比较.采用phage-ELISA法鉴定噬菌体克隆,并对阳性克隆进行交叉反应分析以及序列测定.滴度测定结果显示,Gly-HCl法回收率比竞争法高5～10倍.分别随机挑取20个单克隆进行phage-ELISA鉴定,其中,Gly-HCl洗脱法未获得阳性克隆,AFB1竞争洗脱法得到8个阳性克隆.序列测定结果显示,这8个克隆均编码单域重链抗体.     

磁微粒酶联免疫吸附法测定玉米中的伏马毒素B1

将磁微粒的偶联物替代酶标板作为固定相,用于酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测玉米中的伏马毒素B1(fumonisin B1,FB1)。在直接竞争ELISA反应中,分别引入羊抗兔抗体-磁微粒、蛋白A-磁微粒,并比较二者替代效果。通过对检测方法的优化,使用羊抗兔抗体、蛋白A与磁微粒的偶联物作为固定相的检出限分别为0.024μg/mL和0.030μg/mL。羊抗兔抗体-磁微粒偶联物替代酶标板后具有更低的检出限,为常规ELISA法检测限的三分之一。玉米样品中FB1回收率范围在76.4%~110.6%之间,相对标准偏差小于11%。研究建立了一种灵敏度高、稳定性好的FB1检测方法。