绿原酸与蛋白质氨基酸残基共价互作效率研究

目的 探究绿原酸(Chlorogenic acid,CGA)氧化形成的CGA醌与氨基酸侧链基团在不同pH条件下的反应效率,为CGA与蛋白质共价互作反应位点的调控提供理论依据。方法 利用循环伏安法研究了酸性(pH 5.0)、中性(pH 7.0)和碱性(pH 8.0)条件下CGA与氨基酸侧链基团的反应效率,采用UPLC-QTOF-MS/MS对反应产物进行结构鉴定。结果 在pH 7.0、扫描速率10 mV/s,0.20 mmol/L CGA与10.00 mmol/L封闭α-氨基的氨基酸的反应效率顺序依次为Nα-乙酰-L-半胱氨酸(~100.00%)≈Nα-乙酰-L-色氨酸(~100.00%)> Nα-乙酰-L-酪氨酸(39.20% ± 2.19%)>Nα-乙酰-L-赖氨酸(10.25% ± 0.83%)>Nα-Boc-L-组氨酸(~0.00%)≈Nα-乙酰-L-精氨酸(~0.00%);缩小扫描电压范围及其他反应条件相同情况下,CGA与Nα-乙酰-L-半胱氨酸、Nα-乙酰-L-色氨酸及Nα-乙酰-L-酪氨酸的共价互作效率分别为~100%、12.83% ± 1.16%及~0%;pH 7.0或8.0时GCA与氨基酸残基的共价互作效率高于pH 5.0;CGA醌与Nα-乙酰-L-赖氨酸、Nα-乙酰-L-精氨酸的反应产物以氧化态的醌-氨基酸形式存在,而CGA醌与Nα-乙酰-L-半胱氨酸、Nα-Boc-L-组氨酸、Nα-乙酰-L-色氨酸的反应产物以还原态的酚-氨基酸形式存在。结论 CGA氧化形成的CGA醌可与蛋白质中半胱氨酸、色氨酸、赖氨酸、组氨酸及精氨酸残基发生反应,其中半胱氨酸残基是CGA醌与蛋白质共价互作的主要位点,可通过调整食品体系的pH值和绿原酸醌浓度实现绿原酸-蛋白质共价互作位点的调控。     

L-半胱氨酸抑制多酚氧化酶的机制研究

采用分光光度法和凝胶过滤色谱法研究了L-半胱氨酸抑制多酚氧化酶(PPO)活性的机理。结果表明:以邻苯二酚为底物时,PPO酶促反应产物与L-半胱氨酸结合生成的无色硫氢化合物在295nm处有最大吸收,可作为测定PPO活性的检测波长;分别在410nm和295nm波长下检测醌类物质和硫氢化合物时,已生成的醌类物质可迅速与L-半胱氨酸结合,使410nm处的吸光度迅速降低,而295nm处的则迅速升高;经50mmol/LL-半胱氨酸处理30min的PPO酶液经凝胶过滤色谱分离之后其活性基本没有变化。研究认为:L-半胱氨酸并不是通过对PPO活性中心的结构性修饰,或是发生共价结合来抑制其活性,而是直接与其酶促反应产物——醌类物质结合生成无色的硫氢化合物,从而抑制褐变的发生。利用这一抑制原理,可改进PPO酶活的测定方法。     

β-乳球蛋白与邻苯醌类物质反应效率分析

乳清蛋白作为营养健康食品的重要原料或成分,可能与多酚氧化形成的邻苯醌类物质反应,即发生蛋白-多酚共价相互作用。乳清蛋白与邻苯醌类物质的反应效率是阐明两者反应行为的重要科学依据。以乳清蛋白主要成分β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin,β-LG）作为研究对象,利用循环伏安技术研究了不同条件下β-LG与邻苯醌类物质的反应效率。结果表明：在pH值7.0,扫描速率50 mV/s条件下,β-LG（0.03 mmol/L）与非黄酮型邻苯醌的反应效率顺序为：原儿茶酸（54.72%）>咖啡酸（47.01%）>迷迭香酸（41.86%）>绿原酸（39.29%）>邻苯二酚（27.36%）>4-甲基邻苯二酚（22.51%）>原儿茶酸乙酯（19.24%）,与黄酮型邻苯醌的反应效率的顺序为：木犀草素（19.34%）>槲皮素（14.68%）>芦丁（12.50%）≈儿茶素（11.97%）>表儿茶素（6.66%）。研究表明：邻苯醌类物质的结构会影响其与β-LG的反应效率,醌环上含有给电子基团的邻苯醌类物质反应效率高于醌环上含有吸电子基团的邻苯醌类物质;此外,醌环上取代基的空间位阻会削弱邻苯醌类物质与β-LG的反应效率。     

海藻酸钠/明胶协同固定化假单胞菌B-3酶法合成L-半胱氨酸

目的:研究海藻酸钠/明肢协同固定化假单胞菌B-3的制备条件.以及固定化细胞酶法转化DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)生物合成L-半胱氨酸的工艺条件.方法:比较8种不同的细胞固定化方法,优选海藻酸钠/明胶协同固定化为假单胞菌B-3最佳的固定化方法,并对凝胶组成,增殖活化时间和菌体包埋量等条件进行优化;通过向转化液中添加表面活性剂Tween-60,N-氨甲酰-L-半胱氨酸酰胺水解酶(L-NCC水解酶)激活剂Mn2+和L-半胱氨酸脱巯基酶抑制剂盐酸羟胺来提高L-半胱氧酸产量.结果:以增殖活化10 h的固定化细胞为酶源,DL-ATC·3H2O质量浓度为20g/L,pH 8.0,42℃酶促反应10 h,产物L-半胱氨酸含量达9.18g/L,较游离细胞提高了29.0%,底物转化率达75.83%.固定化细胞重复使用4批次后相对转化率仍能维持在初始值的71.5%.结论:海藻酸钠/明胶协同包埋假单胞菌B-3细胞具有良好的生物转化活性;转化液中添加适量的Tween-60、Mn2+和盐酸羟胺能明显提高L-半胱氨酸产量.     

色氨酸合成酶基因工程菌合成S-甲基-L-半胱氨酸

通过密码子优化设计构建色氨酸合成酶基因工程菌,单因素以及响应面法研究色氨酸合成酶基因工程菌制备S-甲基-L-半胱氨酸。结果表明,温度39℃、pH 8.5、L-丝氨酸浓度360mmol/L,反应平衡时间20 h,S-甲基-L-半胱氨酸的质量浓度为40.49 g/L。     

假单胞菌F12转化DL-ATC产物的鉴定及转化条件的研究

目的:确定假单胞菌F12合成产物是否为L-半胱氨酸,减少生成的L-半胱氨酸的降解,增加转化DL-2-氨基-Δ2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)合成L-半胱氨酸的得率。方法:研究通过高效液相色谱和质谱分析确定产物;在不同反应条件下探索L-半胱氨酸降解情况,找到抑制脱巯基酶降解的因素。结果:通过与L-半胱氨酸标准品比较,液相色谱和质谱结果显示该菌的转化产物为L-半胱氨酸;隔绝空气下L-半胱氨酸降解产生的少量硫化氢对L-半胱氨酸的降解有很强的抑制作用,在此条件下转化DL-ATC合成L-半胱氨酸浓度最高达到46.2 mmol/L,得率由31.6%提高到94%。结论:菌株假单胞菌F12转化DL-ATC产物为L-半胱氨酸,隔绝空气条件下有利于L-半胱氨酸的积累。     

几种抑制剂对小麦多酚氧化酶活性抑制效果研究

使用3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液从全麦粉中提取多酚氧化酶(PPO),以邻苯二酚为底物,研究不同抑制剂在不同浓度下对PPO的抑制作用。结果表明抑制剂浓度为1.0 mmol/L时,各种抑制剂的作用效果分别为:L-抗环血酸90.6%,L-半胱氨酸86.5%,NaHSO3 84%,曲酸75.5%。L-抗环血酸、L-半胱氨酸、NaHSO3、曲酸几种抑制剂浓度减小抑制作用降低。响应面分析得到的L-抗坏血酸、L-半胱氨酸和NaH-SO3最佳抑制浓度组合为:L-抗坏血酸0.4 mmol/L,L-半胱氨酸0.11 mmol/L,NaHSO3 0.25 mmol/L,抑制作用为82.03%。     

高甜度二肽甜味剂的合成与特性

以异香兰素为原料,经Wittig反应、常温常压催化氢化、二异丁基氢化铝还原制得中间体3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙醛。S-叔丁基-L-半胱氨酸甲酯与N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯经1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐以及1-羟基苯并三唑水合物缩合制得二肽化合物N-(N-叔丁氧羰基-4-叔丁酯-L-α-天冬氨酰)-S-叔丁基-L-半胱氨酸-1-甲酯,并在氯化氢-二氧六环溶液中脱保护制得二肽化合物N-(L-α-天冬氨酰)-S-叔丁基-L-半胱氨酸-1-甲酯;然后将中间体3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙醛与N-(L-α-天冬氨酰)-S-叔丁基-L-半胱氨酸-1-甲酯通过亚胺化钯碳氢气常压催化氢化得到目标化合物N-[N-[3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙基]-L-α-天冬氨酰基]-S-叔丁基-L-半胱氨酸-1-甲酯。经红外光谱、质谱以及核磁共振仪对产物进行结构鉴定,确定目标产物结构。     

烤烟中多酚氧化酶促褐变反应抑制剂的筛选

为解决调制、加工过程中烟叶颜色过度转深问题.进行了用柠檬酸、硼酸、二乙基二硫代氨基甲酸钠(NaDDC)、乙二胺四乙酸(EDTA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、ι-半胱氨酸、抗坏血酸(Vc)和硫脲在磷酸盐缓冲溶液中抑制烤烟烟叶多酚氧化酶(PPO)活性试验.结果表明:①PVP(1.0 mmoL/L)、ι-半胱氨酸(0.6 mmol/L)、Vc(1.0 mmol/L)和硫脲(3.2 mmol/L)均能有效抑制缓冲液中多酚氧化酶的活性;②1.0 mmol/L PVP 3.0 mmol/L硫脲 0.75 mmol/L Vc 0.375 mmol/L Z一半胱氨酸或3.0 mmol/L硫脲 0.75 mmol/L Vc 0.375 mmol/L ι-半胱氨酸复合制剂的抑制效果较佳.     

毛细管电泳法分析蜂胶中的黄酮类化合物(英文)

使用毛细管电泳法(CE)检测蜂胶中11种黄酮类化合物:金合欢素、芹菜配基、兰肉桂酸、黄良姜精、阿魏酸、橙皮甙、毛地黄黄酮、柑桔黄素、槲皮素、白藜芦醇、芦丁。确定了一些试验参数的优化条件,如:pH、缓冲溶液浓度、分离电压、进样时间以及UV检测器波长等。用H3BO3-Na2B4O7缓冲溶液(40mmol/L,pH8.85)在206nm波长条件下,各分析物可在19min内测出。相对标准偏差(RSD):8次进样的迁移时间为0.1%～0.3%;峰面积为3.0%～9.7%;各检测限(S/N=10)范围为0.1～0.4μg/ml;回收率为84%～110%。方法简单、灵敏,重现性好,用于蜂胶黄酮类化合物分析结果准确。     

槲皮素抑制蛋白糖基化及DNA损伤

建立牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）-还原糖、牛血清白蛋白-甲基乙二醛/乙二醛（bovineserum albumin-methylglyoxal/glyoxal,BSA-MGO/GO）反应体系,研究槲皮素对反应体系中晚期糖基化终产物（advanced glycation endproducts,AGEs）的抑制作用。考察了槲皮素在不同阶段对BSA-核糖体系中AGEs形成的抑制作用。并对槲皮素抑制二羰基化合物对质粒pBR322DNA的损伤进行研究。结果表明：槲皮素具有抑制BSA-还原糖、BSA-GO、BSA-MGO体系中AGEs形成的作用,达到显著抑制效果的浓度分别为1、0.25、0.25 mmol/L。槲皮素对BSA-MGO体系中AGEs产生的抑制作用强于BSA-GO体系。在BSA-核糖体系中,反应初期随着反应时间的延长抑制作用不断增大,12 d后,抑制作用趋于平缓,维持在60%左右。槲皮素对二羰基化合物对DNA的损伤有抑制作用,且与浓度成一定相关性。     

Analysis of nine kinds of sweeteners in foods by LC/MS

A simple and rapid method for the simultaneous determination of nine kinds of sweeteners (acesulfame potassium, AK; sucralose, SUC; saccharin, SA; cyclamate, CYC; aspartame, APM; dulcin, DU; glycyrrhizic acid, GA; stevioside, STV; rebaudioside A, REB) in various foods by high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry (LC/ESI-MS) was developed. The LC separation was performed on a ZORBAX Eclipse XDB-C18 (2.1 mm x 150 mm) with a mobile phase of 5 mmol/L dibutylammonium acetate (DBAA) and acetonitrile-water (8: 2). Mass spectral acquisition was done in the negative ion mode by applying selected ion monitoring (SIM). The sweeteners were extracted from foods with 0.08 mol/L phosphate buffer (pH 7.0)- ethanol (1:1), and the extract was cleaned up on a Sep-pak Vac C18 cartridge after the addition of tetrabutylammonium bromide and phosphate buffer (pH 3.0). The recovery of the nine kinds of sweeteners from five kinds of foods fortified at the level 0.01 g/kg, 0.05 g/kg and 0.20 g/kg was 75.7-109.2%, and the between-day SD values were 0.5-10.9%. The quantification limits of AK, SA, CYC, APM and STV were 0.001 g/kg, and those of SUC, DU, GA and REB were 0.005 g/kg. A recovery test from each cleaned-up sample solution was necessary to detect ionization suppression.     

浓香型大曲中降解生物胺菌株的筛选及应用

从浓香型白酒大曲中筛选出生物胺降解菌,并研究其生长特性和在固态发酵条件下降解生物胺的能力。利用高效液相色谱法测定发酵液中生物胺含量,得到1株降解生物胺效果最好的酵母菌,经形态学和分子生物学鉴定其为奥默柯达酵母,将其命名为Kodamaea ohmeri HJM。研究K.ohmer HJM的生长特性,得到其最高耐受温度为43℃,乙醇最高耐受体积分数为14%,耐受酸最低为pH 2,并具有较高的葡萄糖耐受性。在固态发酵条件下,利用小麦为发酵基质得到接种菌液样品组和空白对照组中生物胺含量具有显著差异(P<0.05),其对几种生物胺的降解率分别为:腐胺(39.19±0.08)%、尸胺(33.77±0.06)%、甲胺(32.44±0.06)%、乙胺(23.39±0.06)%、吡咯烷(63.42±0.02)%、异戊胺(49.83±0.07)%、环己胺(49.73±0.03)%、环戊胺(66.07±0.08)%。该研究从浓香型大曲中分离出对生物胺降解率较高的菌株,可为白酒中生物胺的调控提供参考价值。     

732阳离子交换树脂对屎肠球菌谷氨酸脱羧酶活性的促进作用

通过对732阳离子交换树脂对屎肠球菌谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase,GAD,EC4.1.1.15）活性的影响进行探讨,构建了732阳离子交换树脂-细胞GAD复合转化体系。结果表明：经含0.2?mol/L?L-谷氨酸（L-glutamic acid,L-Glu）的0.2?mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH?4.2）平衡的732阳离子交换树脂可显著提高屎肠球菌细胞GAD的转化活性,γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）产量较对照组增加了32.30%;L-Glu/谷氨酸一钠（monosodium glutamate,MSG）（2∶1）固体混合物能有效调节反应体系的pH值和维持反应液的底物浓度,显著增加GABA产量,当添加量为30?g/L时,GABA产量较不添加L-Glu/MSG（2∶1）固体混合物的对照组提高了52.40%;732阳离子交换树脂与L-Glu/MSG（2∶1）固体混合物对细胞GAD的转化活性具有协同促进作用,适宜的732阳离子交换树脂-细胞GAD复合转化体系组成为732阳离子交换树脂10?g、0.3?mol/L?MSG溶液（溶于0.2?mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液,pH?4.2）10?mL、100?mg/mL屎肠球菌细胞悬液10?mL和L-Glu/MSG（2∶1）混合物30?g/L。在该反应体系下,80?r/min、40?℃水浴振荡器反应24?h,GABA产量为（4.57±0.11）mmol,较对照组GABA产量（（2.29±0.08）mmol）提高了99.56%。     

高效液相色谱柱前衍生法测定食品中的营养型和非营养型抗坏血酸

应用高效液相色谱柱前衍生法分离测定食品中的营养型 (L型 )和非营养型抗坏血酸 (D异型 )总量。样品中的抗坏血酸经活性炭脱氢 ,在 pH值 5 0的醋酸盐缓冲液中与邻苯二胺进行柱前衍生 ,用磷酸氢二钠、V [二乙胺的水溶液 (pH =7 0 ) ]∶ V (乙腈 ) =90∶10作为流动相 ,在InertsilODS 3柱上得以完全分离 ,经荧光检测器Ex=3 46nm ,Em=42 8nm下检测 ,外标法定量。试验结果表明 ,各组分在 2～ 2 0 μg/mL的浓度范围内 ,线性相关系数均为0 999,RSD值为 3 5 % ,回收率可达 99%～ 10 1%。     

椴树蜜纯度鉴定及其抗氧化活性研究

测定东北地区收集的16批椴树蜜中椴树花粉占总花粉比例;并采用福林酚法测定各批次椴树蜜中的总酚含量;采用DPPH自由基清除法、ABTS+自由基清除法与铁离子还原能力(ferric reducing antioxidant power,FRAP)法测定各批次椴树蜜的总抗氧化能力。结果表明:16批椴树蜜中椴树花粉占总花粉含量分别在7.14%~76.73%之间,椴树花粉含量可用于椴树蜜纯度鉴定,其中7个批次的椴树蜜判定为椴树单花蜜,9个批次椴树蜜为椴树杂花蜜;椴树单花蜜的总酚含量以没食子酸计在174.64μg/g~222.82μg/g,杂花蜜为223.73μg/g~329.18μg/g;DPPH法测得椴树单花蜜的IC50值为(46.61±10.91)g/L~(107.76±34.17)g/L,杂花蜜IC50值为(24.72±6.89)g/L~(76.75±8.09)g/L;测得椴树单花蜜ABTS+自由基清除能力以Trolox计为(0.14±0.07)mmol/kg~(0.43±0.10)mmol/kg,椴树杂花蜜ABTS+自由基清除能力为(0.25±0.01)mmol/kg~(0.56±0.04)mmol/kg;测得椴树单花蜜铁离子还原能力以FeSO4计为(1.96±0.08)mmol/kg~(2.82±0.08)mmol/kg,椴树杂花蜜铁离子还原能力以FeSO4计为(2.08±0.07)mmol/kg~(3.81±0.11)mmol/kg。结果显示,椴树蜜有一定的抗氧化活性,抗氧化活性与总酚含量呈正相关,但与椴树蜜纯度相关性不强。     

分子量对酪蛋白多肽抗氧化活性的影响

在对酪蛋白酶解产物制备工艺进行优化的基础上,对不同分子量抗氧化肽(>3ku,1～3ku,<1ku)的抗氧化活性进行了评价。首先对酶的种类、酶底物比及水解时间进行了单因素实验,最终确定采用碱性蛋白酶,在pH8.0,55℃,底物浓度5%,酶底物比0.192AU/g的条件下,酶解4h所得水解物抗氧化活性最高。经过超滤和凝胶过滤层析分离获得不同分子量的抗氧化肽,并采用2,2′-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS+.)、羟自由基和超氧自由基清除活性评价其抗氧化性。结果表明,ABTS+.清除活性与分子量呈负相关(r=-0.898,p<0.01),分子量低于1ku组分活性最强(2mg/mL,Trolox当量为2.08±0.05mmol/L);分子量低于3ku的抗氧化肽羟自由基清除活性较高(IC50:1～3ku,4.43±0.03mg/mL;<1ku,4.35±0.06mg/mL);分子量高于3ku组分主要分布在3～5ku,超氧自由基清除活最强(10mg/mL,66.1%±1.0%)。     

利用玉米胚内源酶富集γ-氨基丁酸工艺条件的研究

以脱脂玉米胚为原料,利用其中的蛋白酶和谷氨酸脱羧酶(GAD)富集γ-氨基丁酸。通过实验确定的富集工艺条件为:脱脂玉米胚与磷酸盐溶液(0.06mol/L、pH5.7)比例1∶40(g∶mL),反应时间5h,温度40℃,pH值5.7;同时添加600μmol/LCa2+可将GABA产量提高到4mg/g,比未富集时提高了10倍。另外,通过添加底物L-谷氨酸进行反应,脱脂玉米胚与磷酸盐缓冲液(0.08mol/L、pH5.7)比例为1∶40(g∶mL),VB6和CaCl2的添加量分别为3mmol/mol(Glu)和15mmol/mol(Glu),脱脂玉米胚与L-Glu质量之比为45∶1,40℃下反应6h,Glu的转化率可达100%,GABA产量为15mg/g,比未富集时提高40倍。     

槲皮素、山柰酚和芦丁对高果糖和高脂饮食诱导的大鼠代谢综合征的影响

本研究在同一水平比较了3?种结构相似的黄酮——槲皮素、山柰酚和芦丁对大鼠代谢综合征的影响效果。SD大鼠分为5?组：基础饮食组、高糖高脂饮食组（模型组）、加入槲皮素（2.6?mmol/kg?mb）的高糖高脂饮食组、加入山柰酚（2.6?mmol/kg?mb）的高糖高脂饮食组、加入芦丁（2.6?mmol/kg?mb）的高糖高脂饮食组,持续饲喂13?周。测定血清生化指标、氧化应激指标、促炎细胞因子水平和肝脏组织学变化。结果表明：与喂食高糖高脂饲料的模型组（（33.00±0.67）U/L）相比,槲皮素能显著降低大鼠血清谷丙转氨酶活力至（25.00±0.67）U/L（P＜0.05）;山柰酚能有效降低大鼠体质量增加和减少脂肪堆积,且大鼠最终平均体质量比模型组降低了10.7%。在口服葡萄糖耐量实验中,模型组的曲线下面积为（13.80±0.45）mmol/（L·min）,而芦丁组显著下降至（12.10±0.13）mmol/（L·min）（P＜0.05）。说明3?种黄酮均可有效改善大鼠代谢综合征;且尽管这些化合物具有相似的结构,但产生的生物学作用不同。     

FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶发酵、纯化及酶学性质

细菌来源的FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)较为罕见,作者利用乳糖为诱导剂,发酵E.coli BL21(DE3)生产FAD-GDH。7.5 L发酵罐中培养该菌,通过分批补料,分阶段温度控制,酶活达到1341 U/L,菌体量达12.4 g/L。通过镍柱、脱盐柱、阴离子交换柱三步层析对粗酶液分离纯化,获得比酶活109 U/mg的重组酶。SDS-PAGE凝胶电泳显示,重组蛋白质纯化后呈单一条带,相对分子质量约60000。等电聚焦电泳检测酶的等电点pI为5.3。酶标仪全波长扫描吸收光谱表明,该酶的辅基为FAD,与酶非共价键结合。相比其它糖类,以葡萄糖为底物酶的Km最小,为2.56 mmol/L,kcat/Km为3487.7 L/(mmol·s)。该酶在pH 5.5~8.0内稳定,最适反应pH 7.0,当pH高于8.0时酶活迅速降低。差式扫描量热分析(DSC)测得酶的Tm值为77℃,热稳定性良好。本研究为该酶的进一步工业化生产应用提供参考与借鉴。