高通量测序法对清香大曲真菌群落结构的分析

利用微生物生态学方法客观分析清香大曲真菌群落结构有利于分析大曲功能,同时明确大曲功能菌。利用高通量测序法分析了冷季和热季清香白酒生产用曲真菌群落结构。结果表明,用不同的宏基因组DNA提供试剂盒,以及不同测序区域得到较为一致的结果,清香大曲在热季和冷季的主要真菌类群相同,主要的真菌类群有霉菌和酵母,霉菌有Rhizopus oryzae(米根霉)和Lichtheimia corymbifera(伞枝犁头霉),酵母有Pichia kudriavzevii(库德毕赤酵母)和Saccharomycopsis fibuligera(扣囊复膜酵母),2种霉菌含量明显高于酵母,而且冷季酵母比例较热季明显减少。通过本实验可以确认清香大曲主要真菌类群有米根霉、伞枝犁头霉,酵母菌则比较少,主要有扣囊复膜酵母和库氏毕赤酵母。     

襄阳地区高温大曲和中高温大曲真菌多样性解析

采用Illumina MiSeq高通量测序技术对采集自湖北省襄阳市某酒厂的高温大曲和中高温大曲的真菌群落结构进行解析。结果表明,高温大曲真菌类群以嗜热真菌属（Thermomyces）（57.43%）和嗜热子囊菌属（Thermoascus）（30.73%）为主,而中高温大曲真菌类群以嗜热真菌属（Thermomyces）（48.05%）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）（17.72%）和曲霉菌属（Aspergillus）（14.56%）为主。虽然两类大曲共有核心操作分类单元（OUT）包含的序列数占总序列数的64.21%,但经主坐标分析（PCoA）和聚类分析（CA）发现两类大曲在空间排布上呈现明显分离趋势。经线性判别分析效应量（LEfSe）分析发现,导致两类大曲真菌群落结构存在差异的菌属为嗜热真菌属（Thermomyces）。一些真菌类群在高温大曲和中高温大曲中均存在,但两类大曲亦具有各自较为独特的真菌类群。     

隆中对酒业中温大曲真菌类群与理化特性相关性研究

为剖析湖北襄阳地区中温大曲真菌类群与其理化特性之间的关联性，本研究采用高通量测序与纯培养技术对湖北隆中对酒业中温大曲的真菌组成进行了解析，并结合理化与风味指标对大曲品质进行了评价，继而揭示了真菌类群对其品质的影响。结果表明，大曲样本的各理化指标均符合QB/T 4259-2011《浓香大曲》要求，且样品间酯化力和糖化力差异较大(P<0.05)。嗜热真菌属(Thermomyces)、根霉属(Rhizopus)、双足囊菌属(Dipodascus)、曲霉属(Aspergillus)、毕赤酵母属(Pichia)、丝孢毕赤酵母属(Hyphopichia)和青霉属(Penicillium)为其主要真菌属。分离的25株酵母菌被鉴定为扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)和异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。相关性结果表明Hyphopichia对芳香型化合物的形成具有积极作用(P<0.05)。由此可见，湖北隆中对酒业中温大曲蕴含多种真菌有待发掘，且部分真菌代谢有利于有机硫化物和芳香类化合物的形成。     

不同处理方式的大曲真菌群落差异分析

为探究热风干燥工艺对贮存期大曲中真菌群落的影响,采用实时荧光定量聚合酶链式反应和Illumina?MiSeq高通量测序技术分析和比较不同处理方式的大曲真菌群落的差异。结果表明不同处理方式大曲中的真菌18S?rRNA基因拷贝数在1×1011～4.5×1011?copies/g之间,ZR3拷贝数最大为4.5×1011?copies/g。不同处理大曲的优势真菌类群均为嗜热子囊菌属（Thermoascus）、根毛霉属（Rhizomucor）、曲霉菌属（Aspergillus）、假丝酵母属（Candida）。其中嗜热子囊菌属在大曲真菌群落中具有明显的优势,若要保持其优势,需提供曲库的贮存条件;实验室贮存环境相比于曲库更有利于曲霉菌属类的生长;干燥工艺后的环境更利于假丝酵母属类生长。大曲RG3（热风干燥处理的大曲在实验室条件下贮存2 个月）的多样性指数较高,真菌群落有较大的变化,差异性明显;其中耐盐真菌（Wallemia）、丝衣霉菌属（Byssochlamys）、青霉菌属（Penicillium）、曲霉菌属（Aspergillus）是RG3区别于其他大曲的主要真菌群类;同时主成分分析看出大曲RG3落点相对较远,此类大曲有进一步研究的价值,为大曲热风干燥工业化应用提供指导。     

基于16S/18S rRNA基因文库技术研究酿醋大曲固态发酵过程中微生物群落结构演变

针对酿醋大曲发酵过程中不同阶段样品,以16S/18S rRNA基因为目的片段,采用16S/18S rRNA克隆文库法分析大曲中细菌、真菌微生物群落的组成,并通过丰度和多样性分析剖析发酵过程中微生物群落的演变。整个固态发酵过程中,细菌类共检测到4个目14个属,真菌类共检测到3个目11个属。大曲固态发酵过程中微生物群落结构呈现明显动态变化。其中,片球菌(Pediococcus),乳杆菌(Lactobacillus),明串珠菌(Leuconostoc)以及毕赤酵母(Pichia)为固态发酵前期优势菌;泛菌属(Pantoea),肠杆菌属(Enterobacter),阪崎肠杆菌(Cronobacter)以及淀粉霉(Amylomyces),根霉(Rhizopus)为固态发酵中后期优势菌;而芽孢杆菌(Bacillus)以及Rasamsonia,曲霉菌(Eurotium)为固态发酵后期优势菌。PCA分析表明,酿醋大曲固态发酵过程中不同阶段的微生物种群多样性不一,发酵1 d、3 d,发酵7 d、13 d,发酵19 d、25 d、30 d各分为一类。研究大曲制作过程中菌群结构演变,对提高食醋品质具有重大意义。     

河套地区中温大曲真菌类群与理化指标关联性分析

为分析河套地区中温大曲真菌类群及其理化特性，该研究使用MiSeq高通量测序技术对采集自河套地区的中温大曲真菌群落进行解析，样本中平均相对含量>1%的真菌属有7个，分别为嗜热真菌属(Thermomyces)、曲霉属(Aspergillus)、节担菌属(Wallemia)、横梗霉属(Lichtheimia)、根毛霉属(Rhizomucor)、双足囊菌属(Dipodascus)和根霉属(Rhizopus)。理化分析表明，样品间糖化力和酯化力波动较大。关联分析表明，Lichtheimia和Dipodascus均与大曲液化力及糖化力呈显著正相关(P<0.05),Dipodascus亦与水分含量间呈显著相关性(P<0.05);Wallemia与大曲发酵力呈显著正相关(P<0.05),而Rhizomucor不利于该地区中温大曲酒化力形成(P<0.05)。同时，该研究从样品中分离出2株酵母菌，经鉴定均为扣囊覆膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)。综上表明，河套地区中温大曲中含有丰富的真菌类群和一定数目的可培养S.fibuligera,且部分真菌...     

浓香型大曲中可培养真菌的分离鉴定与系统发育学分析

采用传统微生物分离手段从浓香型大曲中分离纯化得到69株真菌。通过形态学观察、分子生物学鉴定以及系统发育学分析其分类地位。结果表明:采用ITS区序列进行真菌的分子鉴定可将大多数的真菌鉴定到属,部分真菌甚至能够鉴定到种;浓香型大曲内分离获得的真菌类群主要包括曲霉属(Aspergillus)、红曲霉属(Monascus)、根毛霉属(Rhizomucor)、横梗霉属(Lichtheimia)、青霉属(Penicillium)、拟青霉属(Paecilomyces)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomala)、锁掷酵母(Sporidiobolus pararoseus)等目前已报道的大曲真菌类群,同时也发现了Merimbla ingelheimensis、踝节菌属(Talaromyces),尾孢菌属(Cercospora)、枝孢菌属(Cladosporium)、Acremonium impicatum、脉孢菌属(Neurospora)等霉菌类群在大曲中分布。其中曲霉属是优势种群,其菌株数目和种类最多,分别占43.48%和20.69%。本研究极大地丰富了对浓香型大曲中真菌种群的认识。     

应用PCR-DGGE指纹技术解析清香型大曲生产过程中酵母群落结构

用PCR．DGGE指纹技术分析了清香型大曲在生产过程中酵母类微生物的演替规律。共检测到Issatchenkla、Pichia、Saccharomyces、Glomeromycota、Saccharomycopsis、Geotrichum、Rhizopus等7个真菌分类属微生物。其Issatchenkla orientalis在大曲整个生产过程中占绝对优势,Glomeromycota为不可培养微生物。     

夏冬两季青稞酒发酵过程中酒醅微生物菌群多样性分析

运用高通量测序技术(high-throughput sequencing)研究夏冬两个季节青稞酒醅发酵过程中的微生物菌群结构和生物多样性。结果显示,在青稞酒醅发酵过程中,夏季酒醅细菌种群多样性要高于冬季,而夏季真菌种群多样性低于冬季;真菌属水平上,夏季微生物组成比冬季更为丰富,在发酵过程中,夏季的青稞酒醅中Pichia、Komagataella占优势,冬季主要有Saccharomycopsis、Saccharomyces、Pichia,且在整个发酵过程中占比均衡;在细菌属水平上,夏季酒醅中的细菌组成较冬季单一,在发酵起始Weissella和Pantoea的数量占优势,随着发酵的进行,从5d开始Lactobacillus逐渐增加并在发酵后期取代其他细菌占主导地位。实验结果表明季节差异对青稞酒醅发酵过程中微生物的组成及群落结构的演替影响显著。     

低温大曲真菌菌群结构解析及其风味品质评价

该研究首先使用高通量测序技术解析长治地区低温大曲中真菌的菌群结构，继而使用电子鼻评价大曲的风味品质，最后对真菌菌群与风味品质进行了关联性分析。通过高通量测序可知，在所有大曲样品中均存在且平均相对含量大于1.0%的真菌属有根霉属(Rhizopus)、曲霉属(Aspergillus)、双足囊菌属(Dipodascus)、丝毕赤酵母属(Hyphopichia)、梗霉属(Lichtheimia)、根毛霉属(Rhizomucor)和复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)。通过电子鼻检测可知，低温大曲中主要的挥发性物质主要为有机硫化物、萜类物质和乙醇。通过相关性分析可知，在真菌属之间，Lichtheimia与Rhizomucor、Hyphopichia与Saccharomycopsis均呈显著正相关(P<0.05);在真菌属与风味品质之间，Rhizomucor与有机硫化物呈显著正相关(P<0.05),Lichtheimia与芳香类物质呈显著正相关(P<0.05)。由此可见，长治地区低温大曲中含有丰富的真菌类群，并且真菌属与风味品质存在一定的关联性。     

丝状真菌改善强化曲品质的研究

将几株课题组保存的丝状真菌进行糖化酶活力检测,挑选出1株高产糖化酶的丝状真菌分枝犁头霉FBKL3.0009。对丝状真菌FBKL3.0009、毕赤酵母FBKL2.0008与地衣芽孢杆菌FBKL1.0199进行不同接种比例的混种固态发酵实验,研究丝状真菌与混培养体系中酵母菌、地衣芽孢杆菌的互相作用。结果表明,丝状真菌的添加对细菌与酵母的生长影响不大,混合发酵体系中丝状真菌的生长越旺盛,糖化酶的活力也就越高,还原糖含量也会随之增加。对培养结束后的麦曲进行理化指标检测可知,与不添加丝状真菌发酵的麦曲相比,糖化力得到提高。对强化曲进行GC-MS风味物质分析,丝状真菌的添加对吡嗪类物质产生有抑制作用。     

不同储藏期浓香型白酒大曲的微生物多样性分析

该研究利用Illumina Miseq高通量测序技术分析不同储藏期赊店老酒浓香型白酒大曲的微生物多样性。结果表明,从3个储存期的大曲样品中共检测到26个细菌属和13个真菌属,其中共有优势细菌属为乳球菌属（Lactococcus）、肠杆菌属（Enterobacter）、乳杆菌属（Lactobacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）;共有优势真菌属为复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）、毕赤酵母属（Pichia）、曲霉菌属（Aspergillus）、耐碱酵母属（Galactomyces）。不同储存期大曲样品群落组成相似,但其优势菌群的相对丰度差异明显。从微生物的菌属特性、平衡角度分析,储存期为6月的大曲更适合投入白酒生产。此外,首次从浓香型白酒大曲中发现耐碱酵母属（Galactomyces）、Arachniotus、norank_c_Cyanobacteria、Escherichia-Shigella、土孢杆菌属（Terrisporobacter）、norank_f_Bacteroi- dales_S24-7_group、Ruminococcaceae_UCG-005和Rikenellaceae_RC9_gut_group。     

基于高通量测序的陶融型大曲微生物群落结构分析

利用高通量测序技术研究成品陶融型大曲的微生物群落结构，并与大曲的理化性质进行相关性分析。结果表明：大曲中共检测到83?个细菌可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU），主要细菌类群为厚壁菌门（Firmicutes）占79.15%、变形菌门（Proteobacteria）占15.30%、放线菌门（Actinobacteria）占4.05%、蓝藻门（Cyanobacteria）占1.42%，其他占0.08%，优势菌属为乳杆菌属（Lactobacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）、泛菌属（Pantoea）、明串珠菌属（Leuconostoc）、Kroppenstedtia、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）、片球菌属（Pediococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、Enterobacteriaceae_unclassified、Mitochondria_norank、伯克霍尔德菌属（Burkholderia）、Cyanobacteria_norank；检测到34 个真菌OTU，其中子囊菌门（Ascomycota）为绝对优势菌群，占99.19%，优势菌属为unidentified、嗜热真菌属（Thermomyces）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）、曲霉属（Aspergillus）、根毛霉属（Rhizomucor）、威克汉姆酵母（Wickerhamomyces）、哈萨克斯坦酵母（Kazachstania）；陶融型大曲中细菌的多样性远高于真菌，大曲主体微生物明显，不同种属的微生物与大曲相关理化指标呈显著相关性。该研究对于指导陶融型大曲制作工艺的优化及陶融型白酒的生产具有重要意义。     

不同生产环境对特香型大曲的影响

采用相同特香型白酒大曲配料和工艺,分别于江西赣江中下游江边和市区制备的大曲样品A和B的理化特性、挥发性成分及微生物组成进行系统的分析。研究发现,大曲A在液化酶活力、蛋白酶活力、酯化力和发酵力等指标上明显高于大曲B,大曲A和B中分别检测到36种和33种挥发性风味物质。高通量测序结果显示,大曲A真菌多样性指数较高,曲霉属（Aspergillus）（相对丰度达6.39%）,为其优势真菌属,大曲B中的嗜热子囊菌属（Thermoascus）（相对丰度达53.18%）,为其优势真菌属。细菌属大曲A以克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）和海洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）为主;而大曲B中含量最高的细菌为产碱杆菌（Alcaligenes）。可见不同生产环境引起特香型白酒大曲中优势菌种的差异,是导致大曲各种酶活力不同的重要原因之一。     

强化曲贮存过程中群落与代谢组分的变化规律

以常规大曲(B)和强化大曲(F)为对象,应用多相检测技术研究其贮存过程中微生物群落和代谢组分的变化.结果表明,贮存过程中2类大曲的糖化力和B曲的发酵力增高,而B曲的酯化力和液化力降低.2类大曲其余的理化性质、挥发性组分含量和微生物群落的 α-多样性指数增减交替变化,且F曲的挥发性含量增高,种类增多.B曲和F曲的最适贮存...     

高通量测序解析白酒中高温大曲细菌和真菌群落结构

采用高通量测序技术,定期采集河南贾湖酒业中高温大曲制备过程中的样品,研究大曲中真菌和细菌群落在整个发酵过程中的动态变化。结果表明,各发酵阶段的细菌和真菌组成均发生动态变化。大曲样品从入房到出房,细菌和真菌数量表现出先升高后降低的趋势,并且都在曲温达到顶温时（大曲JH3）达到最高值。发酵前期主要有假丝酵母属（Candida）、根霉属（Rhizopus）和曲霉属（Aspergillus）,当曲温达到顶温时,横梗霉属（Lichtheimiaceae）成为优势菌群,发酵后期以毛霉属（Mucor）和曲霉属为主。入房和出房大曲中细菌组成变化不大,乳杆菌属（Lactobacillus）是整个过程中的优势菌属。当曲温达到顶温时,高温放线菌科（Thermoactinomycetaceae）克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）成为明显优势菌群,相对丰度达到60.67%。     

基于MiSeq测序技术石花酒大曲中微生物多样性解析

该研究采用Illumina MiSeq高通量测序技术对襄阳市石花酒大曲中微生物多样性进行分析。结果表明,4个样品中优势细菌门（＞0.1%）为变形杆菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）,且均为核心菌门;优势细菌属（＞1%）为假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、链霉菌属（Streptomyces）、魏斯氏菌属（Weissella）、明串珠菌属（Leuconostoc）和Kroppenstedtia。优势真菌门（＞0.1%）为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和Mucoromycota,其中子囊菌门为核心菌门;优势真菌属（＞1%）为复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）、红曲菌属（Monascus）、热子囊菌属（Thermoascus）、青霉菌属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）和Leiothecium。样品中假单胞菌属和曲霉属呈现显著正相关（P＜0.05）。综上,4个石花酒大曲样品中共有大量的核心菌群,且样品中细菌与真菌有一定的相关性。     

强化曲中毕赤酵母与地衣芽孢杆菌的相互作用研究

以实验室分离得到的毕赤酵母FBKL2.0008与产酱香风味的细菌FBKL1.0199作为主要菌种,用于强化麦曲的制备。设置了5个接种比例,30℃发酵14 d后,确定了最佳的接种比例为地衣芽孢杆菌∶毕赤酵母=1∶10。监测强化曲发酵过程中微生物生物量,酸性蛋白酶活,淀粉酶活变化情况,可知毕赤酵母的加入对地衣芽孢杆菌的生长与代谢产物的生成情况没有明显影响。强化麦曲风味物质中吡嗪类物质相对百分含量为19.286%,其中四甲基吡嗪相对百分含量为16.365%。     

不同品温大曲及其曲房空气的细菌群落变化规律和相关性

采用高通量测序技术对中温和高温大曲及其曲房空气细菌群落结构进行研究,同时结合环境因素和大曲细菌群落组成,初步验证环境因素对大曲微生物群落的相关性。高通量测序结果表明:从中温大曲及空气得到33细菌属,其细菌种类数与发酵温度变化呈相反趋势;从高温大曲及空气得到31个细菌属,其细菌种类数在整个发酵过程呈减少趋势;主成分分析发现,中温大曲及曲房空气细菌群落组成在发酵前期基本相似,高温大曲细菌群落组成在整个发酵过程都比较相似,与空气细菌群落组成在发酵前期较为相似。冗余分析显示,淀粉、水分、酸度、大曲品温等6个因素对大曲群落物种分布的解释率为57.41%,经Monte Carlo置换检验发现,淀粉含量、水分、酸度是影响大曲细菌群落组成的主要因素。本研究初步揭示了大曲发酵过程曲和空气的细菌群落动态变化规律和相关性,为今后大曲生产和研究提供了重要参考。