1株产胞外葡萄糖氧化酶黑曲霉的液体发酵条件优化

从土壤中筛选得到1株产胞外葡萄糖氧化酶的黑曲霉菌株1504,通过诱变育种选育得到突变菌株UNⅡ021。为进一步提高产酶活力,对其培养基成分和培养条件进行优化,结果最佳培养基组成和培养条件为:以10%的葡萄糖为碳源,0.5%牛肉蛋白胨和0.5%硝酸钠为氮源,碳酸钙添加量30 g/L,培养基初始pH 5.2,接种量0.05(V/V),培养温度29℃,摇床转速240 r/min。在此条件下,培养4 d菌株UNⅡ021产葡萄糖氧化酶活力达到363.04 U/mL,是优化前的2.14倍。     

产葡萄糖氧化酶菌株的筛选及发酵培养基的优化

从土壤中筛选出了一株产葡萄糖氧化酶较高的菌株,利用响应面法对该菌株的产酶培养基进行优化以提高产酶量。响应面法优化的发酵培养基组成为：葡萄糖109.41g/L、复合氮源(m(月示蛋白胨):m((NH₄)₂SO₄)=3:1)37.36g/L、吐温-80 37.15g/L、KH₂PO₄ 2g/L、 MgSO₄·7H₂O 0.7g/L 和KCl 0.5g/L。采用该优化培养基所得葡萄糖氧化酶的活力为1.54U/mL,较优化前提高了31.6%。     

产纤维素酶霉菌筛选及发酵条件优化

从江苏淮安清江浦区柳树湾树林获取土样为菌种来源,以羧甲基纤维素钠（carboxymethyl cellulose sodium,CMC-Na）为唯一碳源,通过富集培养、初筛、复筛获得3株产纤维素酶能力较强的菌株（Strain-1、Strain-2、Strain-3,S-1、S-2、S-3）,其中S-2产纤维素酶能力最强,其滤纸酶（filter paper enzyme,FPA）酶活力可达0.21 U/mL。对 S-2菌株进行紫外（ultraviolet,UV）诱变,筛选获得菌株SUV2-1。通过单因素试验和响应面试验设计,对该菌株进行发酵培养基优化,得到该菌株产纤维素酶培养基配方：秸秆粉11.63 g/L,蛋白胨2.33 g/L、吐温-80 2.71 mL/L。利用上述培养基在摇瓶发酵条件下得到的FPA酶活力为0.45 U/mL,与优化前菌株的FPA酶活力相比,提高了51.15%;与诱变前的出发菌株相比,酶活力提高了113.00%。     

高产柚苷酶菌株米曲霉的诱变育种及发酵条件优化

以土样中筛选的1株产胞外柚苷酶菌株米曲霉11250为出发菌株,采用紫外诱变、亚硝酸钠化学诱变及紫外-亚硝酸钠复合诱变3种方法进行诱变育种,通过透明圈初筛以及液体摇瓶发酵复筛,最终选育出1株胞外柚苷酶产酶活力较高的突变菌株UN2,该菌株产胞外柚苷酶活力达147U/mL,为原始菌株的2.3倍,经5代传代,其产酶能力稳定在(147±0.8)U/mL。采用单因素试验和响应面设计Box-Behnken design试验相结合的方法进行产柚苷酶的摇瓶发酵培养基配方优化,对影响菌株UN2发酵产酶的碳源、氮源、培养基初始pH、温度等条件做单因素试验和响应面法试验。结果表明:该菌株的最佳产酶条件:麦芽糖2.0 g/100 mL,牛肉蛋白胨3.0g/100 mL,初始pH 5.7,培养温度30℃。在此条件下,柚苷酶活力达到251 U/mL,是未优化前的1.7倍。结论 :通过培养基优化,大幅度提高了米曲霉11250液体发酵产柚苷酶的酶活力。     

产葡萄糖氧化酶菌株的诱变筛选及遗传稳定性研究

采用平板显色初筛、Underbofler滴定法复筛及紫外-硫酸二乙酯复合诱变的方法,从临沂果园土样中得到一株产葡萄糖氧化酶（GOD）活性较好的菌株,命名为Bla-6,其产GOD酶活为（10.50±0.25） U/mL,与原始菌株LPA-4产GOD酶活（6.75 U/mL）相比提高了55.57%。结合5.8S rDNA-ITS区序列系统进化、菌落形态、生长特性、菌体形态等确定其分类地位。结果表明,所得菌株Bla-6被鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger）,经8代传代培养后,GOD酶活维持在10.5 U/mL左右,该菌株遗传稳定性较好。     

海洋低温葡萄糖氧化酶细菌选育及其酶学性质研究

为获得产低温葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)的细菌,提高其产酶能力,研究GOD酶学性质,通过平板显色法从海泥样品中筛选低温GOD生产菌株,经形态特征、生理生化鉴定及分子生物学鉴定确定菌株分类。经诱变育种获得高产GOD菌株,并对所产GOD进行酶学性质研究。研究获得1株编号8-III的高产低温GOD细菌,鉴定为柠檬酸杆菌属(Citrobacters sp. 8-III),产GOD酶活力为0. 75 U/m L。经诱变得到可稳定遗传的突变菌株8-III-a44,产GOD酶活力为1. 77 U/m L,为原始菌株的2. 36倍。最适p H为6. 5,最适作用温度为15℃,在0～35℃有较高酶活力,为低温酶。并且添加K+、Ni2+对GOD活性有明显促进作用。该研究为其在海产品保鲜、饲料防腐方面的应用奠定基础。     

产胞外葡萄糖氧化酶菌株的分离鉴定及其诱变育种研究

从来自全国各地120余份土样中筛选得到1株胞外葡萄糖氧化酶生产菌株1504,经培养特征、形态特征及分子生物学鉴定确定菌株1504为黑曲霉。以黑曲霉1504为出发菌株,采用紫外诱变、亚硝酸钠化学诱变以及紫外-亚硝酸钠复合诱变3种方法对其进行诱变育种,通过3步筛选的方法筛选高产胞外葡萄糖氧化酶的突变菌株。对突变株进行摇瓶发酵试验,最终选育出1株胞外葡萄糖氧化酶产酶活力较高的突变菌株UNⅡ021,该菌株产胞外葡萄糖氧化酶活力达到186.32 U/mL,为原始菌株的3.8倍,经5代传代试验表明,其产酶能力稳定。     

LiCl-ARTP复合诱变选育高产碱性蛋白酶菌株及其发酵条件优化

以地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）E-417为出发菌株,采用氯化锂（LiCl）-常压室温等离子体（ARTP）复合诱变法对其进行诱变,通过酪蛋白平板初筛、摇瓶复筛、遗传稳定性验证筛选高产碱性蛋白酶的优良菌株,并通过单因素及响应面试验对其发酵产酶条件进行优化。结果表明,在氯化锂添加量为1.5%、ARTP照射时间为45 s的最适复合诱变条件下筛选得到1株高产碱性蛋白酶的优良菌株F-3,酶活达到12 147 U/mL,且该菌株传代8次后仍具有良好的遗传稳定性,其最适发酵培养基成分为玉米粉41 g/L、豆饼粉40 g/L、碳酸钠2.1 g/L、磷酸氢二钠2.0 g/L;最适发酵条件为发酵温度37 ℃、初始pH值7.0、接种量8%。在此优化条件下,碱性蛋白酶酶活达到16 156 U/mL,较原始菌株提高75%。     

一株木质素降解白腐菌的筛选、鉴定及其产漆酶培养基的优化

为筛选产木质素降解酶的菌株,采用苯胺蓝-PDA平板法和愈创木酚-PDA平板法从铁皮石斛生长的树皮中筛选到菌株SHIHU-X2,经ITS测序分析将SHIHU-X2鉴定为白腐真菌白黄小脆柄菇(Psathyrella candolleana)。应用响应面法优化产漆酶培养基,结果表明SHIHU-X2菌株产漆酶的最优培养基是:去皮马铃薯200 g/L,葡萄糖20 g/L,蛋白胨1.24 g/L,KH2PO4 1 g/L,酒石酸铵0.02 g/L,CuSO4 0.01 g/L,MgSO4 0.56 g/L,MnSO4 0.057 g/L。漆酶活力从初始产酶培养基1.11 U/mL提高到响应面优化后的2.32 U/mL,漆酶活力提高了109 %。     

产纤溶酶菌株L21的鉴定与发酵条件研究

利用纤维蛋白平板法从海参体内肠道中筛选到一株产纤溶酶活力较高的菌株L21,通过16S rDNA序列测定比对分析,初步鉴定菌株L21为交替假单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）。采用单因素试验、Plackett-Burman试验及响应面法对菌株L21的发酵条件进行优化,结果表明,菌株L21最佳发酵工艺条件为NaCl 1 g/L,CaCl2 1.03 g/L,MgSO4 0.8 g/L,初始pH 7.40。在此工艺条件下,菌株L21纤溶酶活力达到399.86 U/mL,较优化前（86.09 U/mL）提高了4.64倍。体外溶血实验结果表明该菌株具有作为安全性溶栓剂的潜力。     

海洋低温葡萄糖氧化酶生产菌种的选育及发酵条件优化

从大连黄海海域海泥中筛选得到一株高产葡萄糖氧化酶(GOD)的酵母菌,并对其进行菌种鉴定及发酵条件优化。经筛选,得到一株产低温GOD的酵母菌,编号为WYQ 23,其酶活为0.66 U/m L。通过形态学及分子生物学鉴定,确定该菌株为担子菌(Basidioascus sp.)。通过单因素试验优化,确定该菌株产低温GOD最优产酶条件为葡萄糖4%、蛋白胨0.3%、NaNO_30.3%、Mg SO_40.07%、KCl 0.03%、KH_2PO_40.3%、CaCO_30.6%,初始pH值6.0,发酵温度25℃,培养时间38 h。在此优化条件下,该菌株产低温GOD酶活力达到1.67 U/m L,是优化前的2.53倍。     

一株产胶原蛋白酶细菌的鉴定及产酶条件优化

采用形态学特征、生理生化特征结合16S rDNA对一株产胞外胶原蛋白酶的菌株AL-13进行鉴定。获得安全、高效、高产量的生产胶原蛋白酶工艺。以胶原蛋白酶活性为指标,采用单因素实验优化温度、pH、接种量等产酶培养条件后,利用单因素结合响应曲面法优化产酶培养基。结果表明,AL-13鉴定为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus),最适产酶培养条件为:培养时间48 h、培养温度25 ℃、初始pH8.0、接种量6%(v/v),最适产酶培养基为:葡萄糖8.14 g/L、牛肉膏11.63 g/L、氯化钙0.17 g/L、磷酸氢二钾2.08 g/L、氯化钠9.48 g/L,在该产酶条件下胶原蛋白酶活力预测值为154.89 U/mL,验证结果显示酶活为(153.06±3.73) U/mL,此结果与预测值接近,相对误差为0.04%。本实验成功优化了一株产胶原蛋白酶细菌的产酶条件,产酶条件优化后的酶活(153.06 U/mL)较优化前(16.14 U/mL)提高了9.5倍。     

产琼胶酶菌株NBRC102603发酵条件优化及酶的分离纯化

通过正交试验对产琼胶酶海洋菌株NBRC102603发酵条件进行了优化,优化得到的发酵产酶条件为:蛋白胨浓度5.0 g/L、酵母膏浓度1.25 g/L、琼胶浓度4.0 g/L、装瓶量100 mL、接种量1%、转速150 r/min,28℃下发酵48 h后酶活力达到58.94 U/mL,比未优化前提高了2.08倍。经纯化得到琼胶酶A和琼胶酶B,琼胶酶A纯化倍数为17.29倍,酶比活力为870.51 U/mg;琼胶酶B纯化倍数为16.65倍,酶比活力为838.39 U/mg。纯化后琼胶酶经SDS-PAGE检测,显示为单一条带,其相对分子质量酶A约为83.6 ku、酶B约为36.8 ku。     

氮离子束诱变提高黄嘌呤氧化酶产生菌产酶能力

通过氮离子束诱变节杆菌(Arthrobacter sp.g-1984)筛选到黄嘌呤氧化酶高产菌株X7,产酶活力为24.49 U/g,是出发株产酶活力(8.81 U/g)的2.78倍,经发酵条件优化后,产酶活力达到36.67 U/g,是出发菌株产酶活力的4.16倍,产酶高峰缩短了21 h.对细菌黄嘌呤氧化酶酶学性质进行了初步研究,其最适反应条件为37℃、pH 6.5、Fe2 对酶活力有较强的抑制作用,EDTA对酶活力有明显的激活作用.     

产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选及产酶条件优化

为开发新型高产β-葡萄糖苷酶的微生物菌种资源,本实验从腐木中分离获得1株产β-葡萄糖苷酶的青霉菌株L1;经等离子-硫酸二乙酯复合诱变后利用七叶苷平板法初筛,摇瓶发酵复筛,最终获得1株可稳定遗传的突变菌株D-6,经单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和响应面试验确定了其发酵产酶最佳条件。结果表明,最佳产酶条件是:KH_2PO_4 6 g/L、MgSO_4·7H_2O1 g/L、CaCl_2 0.5 g/L、FeS04 0.1 g/L,初始pH5.2,接种量5%(孢子浓度10~8个/mL),碳源添加量(X_1)玉米秸秆45.74 g/L、氮源添加量(X_2)(NH_4)_2SO_47.23 g/L、装液量(X_5) 63 mL/250 mL发酵温度28℃摇床转速160 r/min,发酵时间132 h,D-6菌株的β-葡萄糖苷酶活力为142.92 U/mL,较出发菌株L1提高了274.4%。研究结果为产β-葡萄糖苷酶菌株发酵条件优化提供技术参考同时为该类菌株的开发和应用提供有效的菌种资源。     

β-甘露聚糖酶高产菌株发酵条件优化

从土壤中分离出1株产β-甘露聚糖酶的优良菌株Bacillus sp.QYW-1,具有发酵周期短且产酶活力高等特性,初始酶活力21.85 U/mL。在单因素实验对培养基及培养条件优化的基础上利用Plackett-Burman实验设计对影响产酶的重要因素进行筛选。实验发现,影响该菌株产酶的重要因素是魔芋粉、蛋白胨及硫酸镁。最陡爬坡实验和Box-Behnken实验得到响应面(RSM)优化的最佳培养基为:魔芋粉26 g/L,蛋白胨10 g/L,MgSO43.8 g/L,NaCl 10 g/L,KCl 6 g/L,NaNO36 g/L,K2HPO43 g/L,初始pH6.5。在此条件下菌株发酵产β-甘露聚糖酶酶活力为233.86 U/mL,与模型预测值相符,与单因素优化后的酶活力115.62 U/mL相比,提高了102%。     

豆豉生产中高产蛋白酶的米曲霉诱变及产酶条件优化

为了提高豆豉发酵品质,采用紫外和亚硝基胍方法对产蛋白酶菌株的米曲霉进行诱变处理,以最佳诱变条件筛选得到突变菌株,使其蛋白酶活力提高38.01%,且菌株能够保持较好的遗传稳定性。进一步利用响应面分析法研究培养温度、湿度和时间对该菌株产蛋白酶活力的影响,得到最佳条件为:培养温度42.8℃、湿度84.5%、时间66.6 h,此条件下产酶模型预测值为518.63 U/g,验证实验中产酶活力值为507.87 U/g,表明预测值与实验值拟合良好,达到设计要求,显示诱变所得米曲霉突变株发酵产蛋白酶能力有较大提升。     

一株海洋低温葡萄糖氧化酶担子菌的诱变育种及其酶学性质研究

利用紫外诱变、化学诱变及紫外-化学复合诱变技术对一株海洋来源的产低温葡萄糖氧化酶（GOD）担子菌（Basidioascus sp.） WYQ 23进行诱变育种,并对其遗传稳定性及所产酶酶学性质进行研究。 结果表明,获得一株高产低温葡萄糖氧化酶的突变菌株 Basidioascus sp. WYQ 23-3-4。 该突变菌株GOD酶活为2.33 U/mL,是原始菌株的1.40倍。 经8代传代培养实验表明,突变菌株WYQ 23-3-4产葡萄糖氧化酶能力稳定。 该酶最适温度为20 ℃,在10～30 ℃可保持较高酶活;最适pH值为5.6,在pH5.0～6.0可保持较高酶活; 金属离子Ag+、Zn2+、Fe2+对酶活抑制作用较强,Mg2+、K+对酶有激活作用。 综上,通过复合诱变可明显提高担子菌产低温葡萄糖氧化酶 的能力,为该酶的工业化生产提供了潜在的优良的菌种资源。     

一株产柚苷酶菌株的ARTP诱变育种及培养基的优化

利用常温室压等离子体技术对一株产柚苷酶菌株互隔交链孢霉(A. alternate)SK.37001进行快速诱变处理,获得一株高产柚苷酶菌株A. alternate SK.37002,与野生菌株相比,该菌株发酵酶活提高了208%。通过单因素实验确定发酵产柚苷酶的最适碳源为蔗糖,最适诱导物为柚皮苷,最适氮源为硝酸钠,利用Plackett-Burman试验筛选出影响液态摇瓶发酵酶产量的3个重要因素:硝酸钠、氯化钙、磷酸氢二钾,在此基础上运用最陡爬坡实验逼近最大响应值区域,再利用Box-Behnken设计及响应面分析法进行回归分析,获得最佳培养基配方为:1 g/L柚皮苷,5 g/L蔗糖,5 g/L硝酸钠,0.8 g/L磷酸氢二钾,0.7 g/L氯化钙,0.5 g/L氯化钾,0.5 g/L硫酸镁。采用优化后的培养基进行摇瓶发酵产柚苷酶酶活为624.73 U/mL,与模型预测接近,发酵产酶量比优化前提高了90%。     

酯化型红曲菌复合诱变选育及其固态发酵条件优化

为了获得高酯化力红曲菌,采用紫外线结合常压室温等离子体复合诱变对实验室保藏的红曲菌进行诱变育种,并通过单因素实验及响应面分析法优化其固态发酵条件,提高菌株产酯化酶能力。出发菌株N3经过复合诱变,采用透明圈法初筛及酯化酶活力测定法复筛,得到1株产酯化酶活力高且遗传稳定性较好的诱变菌株Z14,其酶活稳定至34.44 U/g,较出发菌株提高了74%。通过响应面分析法得到优化的固态发酵条件为:接种量为5%、含水量为70%、培养时间为7 d。在该条件下Z14产酯化酶活力达到38.53 U/g,较出发菌株提高了95%。