超声波辅助酶法制备壳寡糖及抗氧化活性研究

壳寡糖是壳聚糖降解后的产物,其与壳聚糖相比分子量更小,水溶性更好,生物利用度更高的特点。本实验拟采用超声波辅助果胶酶处理壳聚糖制备壳寡糖,通过正交试验优化制备工艺。结果表明,最佳工艺条件为:酶浓度1600 U/g,酶解温度50℃,反应时间60 min,超声波功率120 W。在该条件下获得的降解产物中还原糖浓度为1.96 mg/mL,制备效果优于超声波和酶解分别降解的方法。对此法制备的壳寡糖的体外抗氧化活性进行研究,结果表明对DPPH自由基和羟自由基均有较强的清除能力。     

枯草芽孢杆菌壳聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达及其酶解特性

研究枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因（BsCsn46）在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中的高效表达、重组酶性质及其酶解特性。重组菌在5 L发酵罐高密度发酵后胞外酶活力高达50 370 U/mL,蛋白质量浓度15.7 mg/mL。粗酶经强阴离子交换层析纯化,纯酶比活力为4 065.7 U/mg,最适pH 6.0,最适温度55 ℃,在45 ℃以下保持稳定。该酶水解3 g/100 mL壳聚糖得到主产物为二糖、三糖和四糖的壳寡糖,水解率为92.8%,壳寡糖得率为90.9%。本研究的重组壳聚糖酶产酶水平和水解效率高,为工业化制备壳聚糖酶及大规模制备壳寡糖的应用提供了理论支持。     

南极磷虾壳聚糖、壳寡糖的制备与品质鉴定

本研究以南极磷虾壳为原料,制备较高品质的壳聚糖与壳寡糖,并对二者的品质进行鉴定。南极磷虾壳经脱钙、脱蛋白处理,探索脱乙酰反应条件（碱溶液浓度、反应温度与反应时间）,制备具有较高脱乙酰度的南极磷虾壳聚糖,并对壳聚糖的理化指标进行鉴定;探索酶法降解条件（壳聚糖酶添加量、酶解时间）,制备较高纯度的南极磷虾壳寡糖,并对壳寡糖的结构特征进行鉴定。结果表明,使用60%的氢氧化钠于110 ℃脱乙酰处理4 h制备的南极磷虾壳聚糖脱乙酰度为85.74%,粘均分子量为 305.65 kDa,水分含量4.66%,灰分含量0.98%,酸不溶物含量0.40%,各项理化指标均符合食品级壳聚糖的要求;使用壳聚糖酶水解南极磷虾壳聚糖制备壳寡糖,在壳聚糖酶添加量为0.2% （m/V）,酶解16 h条件下,南极磷虾壳寡糖产品得率为46.0%,红外光谱与NMR谱图显示了表征壳寡糖结构的全部特征峰,质谱结果显示南极磷虾壳寡糖主要由二糖(GlcN)₂、三糖(GlcN)₂-GlcNAc与四糖(GlcN)₃-GlcNAc构成。本研究通过制备较高品质的壳聚糖与壳寡糖,为南极磷虾壳的高值综合利用与南极磷虾新产品开发提供了技术支持。     

纤维素酶制备壳寡糖工艺研究

壳聚糖经过纤维素酶催化降解,得到具有生理活性的壳寡糖。以3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定酶水解液中还原糖含量,考察pH、温度、底物浓度、加酶量及反应时间对酶反应的影响,得出最佳反应条件:pH为5.8,温度为55℃,底物浓度为20mg/mL,加酶量为100U/g底物,酶反应时间为4h,薄层层析分析证实有壳寡糖的产生。     

组成型壳聚糖酶制备壳寡糖酶解条件的优化

主要对组成型壳聚糖酶降解壳聚糖制备低壳寡糖的工艺进行了研究。以酶解产物壳寡糖的产量(mg)为指标,酶解pH、酶解温度(℃)、底物浓度(%)、酶解时间(min)为自变量,在单因素试验的基础上,通过正交实验确定了最佳酶解工艺为:酶解pH 7.0、酶解温度50℃、酶解时间90 min、底物浓度1%,此时壳寡糖产含量为5.476 mg。     

壳寡糖及其相关衍生物对幽门螺旋杆菌的抑菌作用

采用打孔方法研究以壳寡糖为代表的益生元对于幽门螺旋杆菌的抑制作用。试验结果显示:不同浓度的壳聚糖、羧甲基壳聚糖未产生抑菌环。壳寡糖B(脱乙酰度为94%)在质量浓度为50 mg/mL的条件下,所形成的抑菌环半径为(4.1±0.23)mm。在质量浓度为10 mg/mL的阳性对照(甲硝唑)条件下,所形成的抑菌环半径为(5.5±0.15)mm。高脱乙酰度的壳寡糖B(50 mg/mL)与幽门螺旋杆菌共培养后导致菌体生物积累量下降,而壳寡糖A(50 mg/mL)对其生长无明显影响。质量浓度为50 mg/mL的高脱乙酰度壳寡糖B具有抑制幽门螺旋杆菌的作用,而壳寡糖A(脱乙酰度为80%)、壳聚糖和羧甲基壳聚糖不具有抑制幽门螺旋杆菌的作用。     

龙须菜酶解制备琼胶寡糖的工艺优化

通过酶解条件的优化来提高琼胶寡糖水解度,以得到低聚合度的新琼寡糖。试验研究了底物浓度、酶解温度、反应p H、加酶量、酶解时间和龙须菜颗粒大小对酶解过程中水解度的影响。酶解产物采用琼胶酶直接酶解龙须菜制备琼胶寡糖,简化琼胶寡糖制备工艺。结果表明,最佳酶解工艺为:底物浓度0.5%,酶解温度45℃, pH 6.5,琼胶酶加酶量10 U/mL,纤维素酶加酶量6.5 U/mL,龙须菜颗粒大小为过40～60目筛,酶解时间5 h,对应的水解度为56.6%,还原糖含量为4.652 mg/mL。通过液相色谱分析酶解产物主要为新琼四糖,存在少量新琼二糖,为功能性琼胶寡糖应用打下基础。     

壳二糖、壳三糖单体制备及其结构分析

壳寡糖因自身结构特征而存在多种生物活性,目前对壳寡糖的活性研究大部分是不同聚合度的混合物。为获得单一聚合度壳二糖、壳三糖,采用了专一性壳聚糖酶对壳聚糖进行降解,运用薄层色谱法(TLC)判断酶解反应终点,并采用高效液相色谱法(HPLC)法进行定量分析。结果表明酶解组分主要为壳二糖、壳三糖,含量分别为65.63%,32.48%。将酶解后的混合组分采用实验室自制的阳离子交换树脂QY-H003对酶解产物进行分离,以盐酸浓度为C_1=1.25 mol/L、C_2=1.55 mol/L为洗脱剂进行梯度洗脱得到两个组分。采用TLC、HPLC、红外光谱(FT-IR)及核磁共振氢谱(1HNMR)检测手段对组分进行分析。分离纯化获得的壳二糖、壳三糖组分经HPLC法检测,纯度分别98.06%,96.00%。壳二糖回收率达92.46%、壳三糖回收率达95.53%。该制备工艺放大后可实现高纯度壳二糖、壳三糖单体规模化制备,为壳二糖、壳三糖的生理活性研究及应用提供物质基础。     

κ-卡拉胶寡糖酶解制备工艺优化

为改进卡拉胶寡糖的制备工艺,本研究以κ-卡拉胶为底物,采用酶法制备κ-卡拉胶寡糖,以还原糖生成量为评价指标,对酶解条件进行优化,并采用薄层色谱法及质谱对酶解产物进行分析。结果显示酶解反应最优工艺条件为:底物浓度12 g/L、p H7.0、反应温度40℃、振荡速率100 r/min,经优化后的酶解反应更完全,还原糖生成量由0.91 mg/m L提高至1.61 mg/m L,提高了77%,酶解卡拉胶反应的Km值为171.96 mg/m L,最大反应速度Vmax为0.925 mg·m L~(-1)·min~(-1)。最优工艺验证实验和20 L放大实验结果一致,经薄层色谱及质谱分析酶解24 h后的反应主产物为二糖和四糖。     

响应面分析法优化微波处理玉米芯酶法制备低聚木糖工艺

针对微波处理玉米芯酶法制备低聚木糖的工艺,通过单因素实验选取实验因素与水平,在单因素实验的基础上采用3因素3水平的响应面分析法,依据回归分析确定各工艺条件的影响因子,以还原糖含量为响应值作响应面图。结果表明:微波处理玉米芯酶法制备低聚木糖的最佳工艺条件为微波处理压力2.0MPa、微波处理时间4min、加酶量0.8%(相对于原料玉米芯),在此条件下水解液中还原糖含量可达到10.44mg/mL。最佳条件下的TLC显示:微波处理玉米芯酶解液主要成分以木二糖和木三糖为主,另有少量的木四糖以及很少量的木糖。     

酶膜耦合法制备高聚合度壳寡糖

为了制备高聚合度壳聚糖,本研究通过对比分批酶解法和酶膜耦合法制备所得壳寡糖产物的聚合度差异,探索了利用酶膜耦合技术高效富集制备高聚合度壳寡糖的可行性。研究结果表明,酶膜耦合方法所得壳寡糖产物中DP 4~8壳寡糖的总收率高达78.1%,DP 4~8壳寡糖所占比例分别为16.5%、35.8%、18.9%、7.81%和5.12%。同时,以卷式膜系统代替板式膜系统,通过错流过滤的方式,可以有效降低实验过程中的不可逆膜污染(R_if=1.56×106 m-1),提高了料液底物浓度(30 g/L)。综上所述,本研究建立了一种基于酶膜耦合技术的高聚合度壳寡糖连续制备工艺,为高聚合度壳寡糖的应用和功能研究提供了基础。     

壳寡糖制备过程中还原糖的全自动电化学测定

采用还原糖电化学分析仪测定壳寡糖制备过程中还原糖的含量。仪器线性范围0.005%～0.500%氨基葡萄糖,检测限为0.005%。通过还原糖含量的变化,研究了不同酶促条件如温度、pH、底物浓度对反应的影响,优化了酶解工艺,并得到酶促反应中还原糖浓度变化与产物聚合度的关系。通过实验发现,还原糖电化学分析仪适合测定壳寡糖制备过程低浓度还原糖,仪器方法快速、准确、灵敏度高。     

蒸汽爆破预处理联合壳聚糖酶制备壳三糖

为解除壳聚糖底物的不溶解性对壳聚糖酶的限制,并实现单一聚合度壳寡糖的绿色制备,该研究对壳聚糖进行蒸汽爆破预处理,随后使用在枯草芽孢杆菌WB800中高效表达的壳聚糖酶Csn-But进行酶解。扫描电镜结果显示,经过2.4 MPa蒸汽爆破处理的壳聚糖显示多刺的纤维状细枝排列,且表面被明显撕裂,分离和暴露的纤维中含有多个空腔。傅里叶变换衰减全反射红外光谱结果显示蒸汽爆破处理后壳聚糖的化学键未被破坏,氢键网络被破坏。使用壳聚糖酶Csn-But酶解在2.4 MPa蒸汽爆破压力下处理的壳聚糖48 h后,壳寡糖含量较未预处理对照组提高5.4倍,产物浓度达到2.0 mg/mL。并通过调控底物浓度,在作用6%浓度的底物时,实现了高纯度壳三糖的制备。     

响应面法优化Bacillus thuringiensis ZJOU-010产壳聚糖酶

目前,利用壳聚糖酶降解壳聚糖已成为生产功能性壳寡糖的首选途径。本研究在单因素试验的基础上,通过响应面法结合中心组合设计优化了Bacillus thuringiensis ZJOU-010产壳聚糖酶的培养条件。结果表明：当虾壳粉质量浓度为44.96g/L、(NH4)2SO4质量浓度为1.48g/L、pH值为6.78时,B. thuringiensis ZJOU-010的壳聚糖酶活力达到4.25U/mL。优化后获得的实验值与模型的预测值(4.16U/mL)基本相符,且较优化前的酶活力(3.59U/mL)提高了18.47%。研究表明,利用生物催化技术以虾加工企业的副产物--虾壳粉为唯一碳源和氮源生产壳寡糖是可行的。     

响应面法优化组成型壳聚糖酶酶解条件

以壳聚糖为原料,通过蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）发酵所得壳聚糖酶水解壳聚糖产生壳寡糖,对酶解pH、温度、底物浓度和时间分别进行单因素试验,并在此基础上,通过响应面法研究这4种因素对壳寡糖产量的影响,优化酶解条件。结果表明,壳聚糖酶酶解的最佳条件为pH值5.6,酶解温度53 ℃,壳聚糖质量分数2.09%,酶解时间157 min。在该优化条件下,壳寡糖的浓度为35.73 μmol/mL,与模型预测值35.476 μmol/mL接近,则该模型可用于优化壳聚糖酶酶解条件。     

海洋菌株Mitsuaria sp. SH-50产嗜热性壳聚糖酶CsnSH50的酶学性质表征及其应用

实验室从中国海南滨海虾蟹养殖区泥土样品中筛选到一株高产壳聚糖酶的海洋菌株Mitsuaria sp. SH-50,优化后该菌株产酶时间仅为12 h,产酶活性可达26.6 U/mL。该研究对其胞外壳聚糖酶进行分离纯化和酶学性质表征并进行壳寡糖制备的小试放大试验,以期进一步明确该菌株在壳寡糖生产上的实际意义。结果表明：壳聚糖酶CsnSH50分子量约为41 ku,纯化后CsnSH50比酶活力为7 462.50 U/mg,最适反应pH值为4.5,温度为75 ℃,在pH值2.5~8.5及温度低于50 ℃条件下稳定性较好。最适条件下,稀释后CsnSH50的最大反应速率Vmax=29.41 U/mL,米氏常数Km=1.71 mg/mL,1 mmol/L的K+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+对CsnSH50的酶活力有明显正激活效应,10 mmol/L的Mn2+对其正激活效应可达412%。TLC和ESI-MS结果表明：CsnSH50水解壳聚糖的最终产物主要为壳二糖、三糖、四糖。小试放大试验结果显示：制备5%（m/V）壳寡糖溶液时,壳聚糖溶液的初始pH值3.5,温度75 ℃,水解120 min时壳寡糖产率达到92.1%,产物平均聚合度为10.2。综上,CsnSH50具有酶活性高、热稳定性好、耐酸等特性,同时是一种鲜有报道的嗜热性壳聚糖酶,具有良好的工业应用潜力。     

山楂果胶寡糖生成诱导条件的研究

探讨山楂果胶寡糖生成诱导条件,考察了Rapidase和粉末果胶酶在不同的酶解时间、底物浓度和加酶量的条件下对山楂果胶的分解效率及山楂果胶寡糖的生成动态.结果表明,两种果胶酶的酶解液中还原糖的含量在反应开始的4h内呈现快速上升的趋势,之后随反应时间的延长其变化趋于平稳;而作为酶解产物的寡糖的平均重合度则显示出与还原糖含量相反的变化规律.实验结果同时也表明,山楂果胶溶液的浓度与山楂果胶寡糖的平均重合度之间呈现出一定的正相关关系,即在高底物浓度(≥2%)的条件下有利于分子量相对较大(平均重合度大于3)的寡糖生成.但果胶酶的使用剂量则与果胶寡糖的平均重合度之间则呈现出一定的负相关关系,即在底物浓度一定的条件下,高的加酶量(≥O.2U/mL)有利于分子量较低(平均重合度小于3)的寡糖生成.     

重组内切几丁质酶的纯化及其催化壳聚糖降解的研究

目的:研究重组内切几丁质酶的分离纯化及其催化壳聚糖制备壳寡糖的反应条件优化。方法:重组菌发酵液经PEG20000浓缩和DEAE-Sepharose FF离子交换层析后,测定总蛋白含量和内切几丁质酶活力。用纯化的内切几丁质酶催化壳聚糖制备壳寡糖,探讨其最佳的反应条件。结果:纯化的内切几丁质酶比活力41.34U/mg,纯化倍数2.49,酶总回收率89.63%。内切几丁质酶催化壳聚糖降解制备壳寡糖的最优化反应条件是:壳聚糖质量分数4%,p H7.0,温度30℃,时间12 h。结论:本研究结果为内切几丁质酶和壳寡糖的产业化应用奠定了良好基础。     

甲壳低聚糖制备及其抗氧化活性研究

甲壳低聚糖是壳聚糖降解后的产物,其与壳聚糖相比分子量更小,水溶性更好,生物利用度更高。采用超声波协同α-淀粉酶处理壳聚糖制备甲壳低聚糖,以还原糖含量作为产品制备收得率的指标,通过正交实验优化制备工艺。结果表明,最佳工艺条件为:酶浓度1 000 U/g、酶解温度55℃、反应时间50 min、p H 5.2。在该条件下获得的降解产物还原糖浓度为2.25 mg/m L,制备效果优于单独超声波和酶解降解方法。对此方法制备的甲壳低聚糖的体外抗氧化活性进行研究,与抗坏血酸对比,其对DPPH自由基和超氧阴离子(O2-·)均有较强的清除能力。     

壳聚糖／壳寡糖衍生物的制备及其抗氧化性能研究

壳聚糖和壳寡糖经化学改性得到季铵盐衍生物-O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/壳寡糖,通过红外光谱对其结构进行表征.考察了两种季铵盐衍生物对DPPH自由基的清除活性以及还原能力.当质量浓度为0.6 mg/mL时,壳聚糖季铵盐和壳寡糖季铵盐对DPPH自由基的清除率分别为9.5 %和29.3 %.在还原体系中,当质量浓度为2.5 mg/mL时,其吸光度分别为0.11和0.43.结果表明:通过化学改性,得到的壳聚糖季铵盐衍生物水溶性优良、具有抗氧化活性;壳寡糖季铵盐清除自由基的活性和还原能力强于壳聚糖季铵盐衍生物.这可能由于壳寡糖分子链短,更多活性氨基和羟基暴露出来参与抗氧化反应所致.