PCR法快速检测三种食源性致病菌的研究

目的 探讨用PCR方法快速检测食品中沙门氏菌(Salmonella spp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和志贺氏菌(Shigella spp.)的实用性。方法 采用能力验证实验和超市样品检测实验对PCR方法与传统检测方法进行比较。结果 与传统检测方法相比, PCR方法检测以上三种食源性致病菌的结果准确率达到99%以上, 假阳性率低于1%, 假阴性率为0。结论 PCR检测方法具有检测周期短等优点, 可以在当前的食品安全检测工作中应用推广。     

基于实时荧光核酸恒温扩增技术的食源性致病微生物检测

目的考察实时荧光核酸恒温扩增(simultaneous amplification and testing,SAT)技术在食源性致病微生物检测中的应用价值。方法以国标培养法及分子测序为参考方法,研究SAT方法用于检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌及单增李斯特氏菌的灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率、准确度,同时利用卡方检验分析阳性率显著性差异。结果 4种致病菌SAT试剂盒的灵敏度均为100%,不存在假阴性及漏检情况;沙门氏菌(94.2%)、金黄色葡萄球菌(99.5%)、副溶血性弧菌(100%)和单增李斯特氏菌(100%)的特异性符合要求,假阳性率均小于9.6%,准确度均大于94%。结论 SAT技术具有高灵敏度、特异性强、准确度高,可作为上述4种致病菌的检验方法。     

新型试纸条在食源性致病菌检测中的应用

近年来,由食源性致病菌引起的食品安全事件频频发生,其中,以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、单增李斯特菌等致病菌引起的感染尤为常见。目前常用的食源性致病菌检测方法常需借助大型仪器完成,操作步骤繁琐,不利于现场检测。因此,建立一种针对食源性致病菌的快速准确检测方法尤为重要。试纸条检测方法因其便携、灵敏度高、快速高效及成本低等优点,广泛应用于食源性致病菌的快速检测。针对新型试纸条检测方法进行综述,阐明了其在食源性致病菌检测中的应用。     

基于核酸等温扩增技术金黄色葡萄球菌检测的研究进展

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作为一种食源性致病菌,是导致食品安全和公共卫生事件的主要病原体之一,开发快速准确的金黄色葡萄球菌检测技术是保障食品安全和提高食源性致病菌防控水平的关键措施。核酸等温扩增技术具有检测速度快、灵敏度高和设备简单等优点,在金黄色葡萄球菌检测方面具有很大的应用前景。基于此,该文简要介绍了核酸等温扩增技术的原理及优缺点,主要阐述了核酸等温扩增技术在金黄色葡萄球菌检测上的应用,并总结了目标产物检测技术,为金黄色葡萄球菌等温扩增快速检测技术的开发提供理论支持,为食品安全控制和食源性致病菌监控工作奠定基础。     

二重环介导等温扩增法快速检测乳粉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌

为建立能够同时检测乳粉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的二重环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。针对沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因保守区域设计LAMP引物,优化引物浓度,并通过熔解曲线分析判断扩增靶标来源,建立同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的二重LAMP检测方法。结果表明,当沙门氏菌与金黄色葡萄球菌引物浓度比为3∶1时,建立的二重检测体系扩增效率最佳;该方法特异性强、灵敏度高,对6株目标菌株和9株非目标菌株进行检测,未产生任何假阳性和假阴性结果,对2种食源性致病菌的检测灵敏度均达到102 fg/μL;根据熔解曲线中的退火温度可准确判断目标菌株,实现不同菌株的有效区分。建立的二重LAMP方法可用于乳制品企业大规模乳粉样品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的现场快速筛查。     

快速检测金黄色葡萄球菌活菌的研究进展

金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的常见食源性致病菌之一,如何快速准确检测食品中的金黄色葡萄球菌是预防其引起大规模疾病爆发的关键环节。传统的检测方法不易区分死活菌,易导致假阳性或假阴性结果的出现。重点综述了近些年建立的常用金黄色葡萄球菌活菌快速检测的方法,分析比较了各检测方法的优缺点,以期为金黄色葡萄球菌活菌检测技术的进一步开发利用提供方法参考。     

3种食源性致病菌多重PCR检测体系的建立

目的:探究用PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella spp.)及志贺氏菌(Shigella spp.)的检测灵敏度,建立快速检测3种食源性致病菌的多重PCR方法。方法:分别依据金黄色葡萄球菌的fem A、沙门氏菌的hil A基因及志贺氏菌的ipa H基因设计3对特异性引物,对3对引物进行多重PCR反应体系构建与优化。结果:建立的多重PCR方法具有灵敏度高、特异性强、方便快捷的优点。结论:研究结果为上述3种食源性致病菌快速检测试剂盒的研发及在食品安全检测工作中的应用提供了重要技术保障。     

实时荧光核酸恒温扩增技术检测食品中金黄色葡萄球菌的方法评价

目的 以传统国标培养法作为参比方法, 评价实时荧光核酸恒温扩增检测(real-time simultaneous amplification and testing, SAT)方法检测食品中金黄色葡萄球菌的能力。方法 依据 GB 4789.10—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》对SAT法检测食品中金黄色葡萄球菌的能力进行评价。分别检测纯培养物、人工污染样品以及实际样品来评价试剂盒的灵敏度、特异性、假阴性率、假阳性率和准确度, 同时采取2种方法的显著性差异分析, 确定最终结果。结果 SAT法灵敏度为100, 纯培养物检出限为103 CFU/mL, 人工污染检出限灵敏度为103 CFU/mL, 假阴性率为0、假阳性率为2.9%; 金黄色葡萄球菌的特异性符合要求。结论 SAT检测方法灵敏度高、特异性好, 假阳性率、假阴性率、准确度等检测结果全部达标, 并且检测时间短, 适用于食品中金黄色葡萄球菌的快速检测。     

乳品中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌快速检测的新体系

食源性致病菌污染是乳制品安全问题的重要隐患之一,乳品中常见的食源性致病菌有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌等。目前,乳品中致病菌的检测以培养法为主,但此类方法操作较为繁琐,且耗时长,不能满足检测的时效需求。本文探索了荧光定量PCR技术在快速检测乳品中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的应用,并进行了大量的验证试验和实际检测,形成了乳品中致病菌快速检测的新体系。该体系可以在24h内完成金黄色葡萄菌和沙门氏菌的增菌与检测,缩短了整体检测时间,降低了检测成本,为进一步改良乳品中致病菌快速检测提供了参考数据。     

重大活动食品安全保障中21家酒店微生物评估结果分析

目的:在重大活动前期,对21家拟接待酒店开展3轮次的微生物评估,预测其可能存在的食品安全隐患,为监管部门采取有效措施提供依据,确保重大活动期间食品安全事故零发生。方法:抽取餐饮具280批次,检测项目为大肠菌群和沙门氏菌;抽取自制散装食品589批次,检测项目为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、致病性大肠埃希氏菌O157:H7、副溶血性弧菌和单增李斯特氏菌;抽取接触自制散装食品的五指、刀具、砧板、厨师工作服围裙、袖口等表面微生物样品332批次,检测项目为菌落总数;本次评估中5类食源性致病菌的检测均采用恒温荧光微生物快检技术。结果:餐饮具中大肠菌群检出率为3.57%(10/280);自制散装食品的致病菌总检出率为0.51%(3/589);五指和工作服围裙及袖口菌落总数较多,刀具和砧板菌落总数的污染情况良好。结论:重大活动的食品安全保障工作应加强对餐饮具和自制散装食品的监测,提高酒店相关人员的食品安全意识,发挥微生物快检技术的优点,为保障工作服务。     

免疫磁珠-环介导等温扩增快速检测牛肉中的鼠伤寒沙门氏菌与金黄色葡萄球菌

建立免疫磁珠分离（immunomagnetic separation,IMS）联合环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术检测牛肉中鼠伤寒沙门氏菌与金黄色葡萄球菌的方法。用生物素标记的鼠伤寒沙门氏菌抗体和生物素标记的金黄色葡萄球菌菌体蛋白抗体对链霉亲和素磁珠进行功能化,从牛肉中捕获和分离目标致病菌。结果表明：经优化后,每毫克磁珠与10 μL鼠伤寒沙门氏菌抗体偶联,400 μL鼠伤寒沙门氏菌免疫磁珠在45 min内对104 CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌的捕获率为52.16%;每毫克磁珠与6 μL金黄色葡萄球菌抗体偶联,300 μL金黄色葡萄球菌免疫磁珠在30 min内对104 CFU/mL金黄色葡萄球菌的捕获率为56.80%;建立的IMS-LAMP方法特异性高,对牛肉中鼠伤寒沙门氏菌的检测灵敏度为1.2×103 CFU/mL,对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为4.4×104 CFU/mL;富集5 h后,鼠伤寒沙门氏菌的检测限可至1.2 CFU/mL,富集7 h后,金黄色葡萄球菌的检测限可降至4.4 CFU/mL。建立的IMS-LAMP方法用时短,灵敏度高,操作简单,可以有效检测牛肉中的鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。     

6种食源性致病菌质控考核结果分析

目的对承担食品安全风险监测任务的全国各级疾病预防控制中心开展微生物质量控制考核,以评价其对6种食源性致病菌的检验能力。方法 6种质控考核菌株包括单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽胞杆菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希菌、沙门菌以及金黄色葡萄球菌。按照2011和2012年设计的组合,将新鲜培养的致病菌增菌液混合后滴加于灭菌奶粉载体中制成样品。2011年考核制备了6种样品(I~VI),2012年为10种样品(A~J)。运用点分数法对两年结果分别进行满意率评价,率的比较用Pearsonx~2检验或对数似然比x~2检验。结果 2011和2012年考核总体满意率分别为86.5%(268/310)和84.3%(375/445),2011年样品满意率最低的是空白样品VI(68.0%,17/25),2012年满意率最低的是G样品(0.0%,0/8)。2011和2012年考核结果主要漏检的是大肠埃希菌,其中2012年大肠埃希菌漏检率占漏检总数的85.7%(60/70)。2011年非考核菌中漏检最多的是金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌。2012年考核结果主要多检的是金黄色葡萄球菌,占多检总数的36.8%(7/19)。两年的结果均显示大肠埃希菌和阪崎肠杆菌组合样品中,大肠埃希菌的漏检率明显增高。沙门菌和大肠埃希菌的血清分型正确率较低,分别为41.5%(95/229)和45.1%(105/233)。单核细胞增生李斯特菌易错误鉴别成英诺克李斯特菌,蜡样芽胞杆菌易错误鉴别成蕈状芽胞杆菌,阪崎肠杆菌易错误鉴别成河生肠杆菌。结论 80%以上的疾病预防控制中心对6种致病菌的定性检验能力较好,可以满足食品安全风险监测的需求。其中对沙门菌的检验能力最高;金黄色葡萄球菌漏检率较低但易出现多检;大肠埃希菌的检验能力有待提高;阪崎肠杆菌的检验水平较2010年结果有明显提升。     

多重PCR快速检测三种食品病原菌

建立一种快速、经济、实用的可以同步检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法。根据金黄色葡萄球菌的nuc基因,沙门氏菌的invA基因,小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基因,分别设计了三对引物,对单个基因PCR和单管多重PCR扩增进行特异性、灵敏性实验以及优化反应体系。三对引物能特异性扩增出236、475、127bp的目的条带。建立的多重PCR同时对3种食源性致病菌进行检测具有较高的灵敏度,灵敏度金黄色葡萄球菌为102CFU/mL、沙门氏菌为102CFU/mL、小肠结肠炎耶尔森氏菌为102CFU/mL。初步建立能同步、简便、快速、灵敏地检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌的三重PCR方法。     

双重PCR-DHPLC技术快速检测水产品中金黄色葡萄球菌

根据编码金黄色葡萄球菌肠毒素A的sea基因、编码耐热核酸酶的nuc基因为目的基因,设计两对特异性引物,利用聚合酶链式反应结合变性高效液相色谱技术,建立水产品中金黄色葡萄球菌的双重PCR-DHPLC检测方法。以30株参考菌株进行特异性实验,除所试8株金葡菌出现目的片段和阳性吸收峰外,其余菌株均未检测到目的片段与阳性吸收峰,表明该方法具有良好的特异性。灵敏性实验结果表明,检测灵敏度达到菌液浓度50CFU/mL,比普通的凝胶电泳高一个数量级。利用建立的双重PCR-DHPLC检测方法对240份水产品进行检测,共检出22株金黄色葡萄球菌,检出率为9.2%,其中含有肠毒素基因有8株,占总样本的3.3%,与国标法检出阳性率比较无显著差异,证明该方法具有良好的实用性。实验证明,本研究建立的双重PCR-DHPLC方法不仅可以特异、灵敏、简便快速且高通量的实现对水产品中金葡菌的检测,而且也可通过对肠毒素基因的分析,方便地判断出该菌株致病性的强弱。     

多重PCR检测婴幼儿配方奶粉中3种食源性致病菌

为建立一种能够同时检测婴幼儿配方奶粉(Powdered Infant Formula,PIF)中克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌3种食源性致病菌的多重PCR检测方法。通过单重PCR验证了9对引物的特异性,筛选出其中3对特异性好的引物建立了多重PCR体系,对其特异性和灵敏度进行评价,并将其应用于人工污染PIF中3种食源性致病菌的检测。结果表明,针对克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等3种食源性致病菌所筛选的3对引物分别能扩增出469、638和796 bp的目的条带,具有高度特异性。多重PCR检测体系的最佳退火温度为55℃,最佳Mg2+浓度为2.00 mmol/L,最佳引物浓度为400 nmol/L。在此条件下3种目的菌在102 CFU/mL均可同时扩增出较清晰条带。将建立的多重PCR检测体系应用于人工污染PIF中3种食源性致病菌的检测,其检出限达到103 CFU/g。本研究初步建立了一种能准确、快速、特异性的检测PIF中克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR方法,适用于PIF中3种常见的食源性致病菌的快速检测。     

2013年云南省市售特色食品中细菌性污染情况调查

调查云南省市售特色食品中细菌污染状况。 方法 采用国家标准规定的检测方法,对2013年云南省4个有代表性的州市市售特色食品进行卫生指标菌和常见食源性致病菌检测,并用SPSS 19.0软件对测定结果进行分析。 结果 在10类食品的288份样品中卫生指标菌不合格率为56.50%,食源性致病菌总检出率为12.15%,均为散装产品;沙门菌主要来自凉拌生猪皮和凉拌食品,检出率分别为8.33%和3.13%;金黄色葡萄球菌检出最高的为凉拌生猪皮,为31.25%,其次为乳扇25.00%;蜡样芽胞杆菌在凉拌食品中检出率低(7.81%);志贺菌和致泻大肠埃希菌在散装食品中未检出。全年4个季度沙门菌和金黄色葡萄球菌的检出率差异无统计学意义(P＞0.05)。 结论 云南省市售特色食品,特别是散装样品,细菌性污染严重。考虑到食品的即食性,原料来源不可控,无熟制过程,存在较大食品安全隐患,应进一步加强相关食品的卫生监管。     

2014~2016年丽江市食品中食源性致病菌监测结果分析

目的 了解丽江市食品中食源性致病菌的污染状况, 为开展丽江市食品安全评估和确定高风险食品种类和分布提供科学依据。方法 2014~2016年采集丽江市售食品344份, 对沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、蜡样芽孢杆菌6种食源性致病菌进行监测分析。结果 344份食品样品检出食源性致病菌51株, 总检出率为14.82%。3年食源性致病菌检出率分别为21.00%、15.13%和9.60%, 不同年份检出率差异有统计学意义。检出的4种食源性致病菌, 其中以蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌检出率最高, 分别为8.14%和3.49%; 空肠弯曲菌、副溶血性弧菌未检出。米米制品、学生餐(盒饭)和生肉类污染严重, 检出率分别为23.53%、18.18%和16.92%。结论 丽江市辖区市售食品中存在不同程度的食源性致病菌污染, 食品安全监管部门应加强食品安全监督管理。