苦荞对发酵豆乳纳豆激酶活力、风味及抗氧化活性影响

相较于纳豆,以纳豆芽孢杆菌发酵获得的发酵豆乳食用更方便,但同样存在纳豆激酶活性低、风味不良等缺点。作者首先研究了苦荞、糙米、薏米、藜麦、燕麦粉对纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶能力的影响。结果表明,添加苦荞的效果最好,当添加质量分数为3%时,纳豆芽孢杆菌液体发酵的酶活力由原来的5 803.12 U/mL提高到23 326.23 U/mL;然后研究了苦荞粉对纳豆芽孢杆菌发酵豆乳的纳豆激酶活力、风味及抗氧化活性的影响。结果显示,当添加的苦荞质量为大豆质量的50%时,发酵豆乳的纳豆激酶活力、挥发性盐基氮质量浓度和总抗氧化能力分别为 4 460.28 U/mL、3.45 mg/dL和16.34 mmol/L,分别为纯大豆发酵所得豆乳的161.42%、79.84%和196.39%。添加苦荞能够明显提高发酵豆乳中纳豆激酶活力,并且改善风味和抗氧化活性。该研究可为开发富含纳豆激酶、食用方便的纳豆食品提供借鉴。     

高产纳豆激酶菌株的分离与发酵纳豆过程中生物胺的变化

采用纤溶活性筛选法从贵州织金农家土制烟熏腊肉中分离到一株高产纳豆激酶菌株GULR06,对菌株的菌株形态、生理生化特征、16S rDNA序列分析以及系统发育分析,鉴定该菌株GULR06为枯草芽孢杆菌。以黄豆为主要原料进行固态发酵制备纳豆,通过高效液相色谱法对发酵过程中的生物胺进行检测,同时考察了发酵过程中纳豆激酶活力和生物量的变化。实验表明：尸胺、腐胺、2-苯乙胺、色胺、精胺、酪胺、亚精胺、组胺都能得到很好的分离,且线性关系良好,R2均大于0.994?0,相对标准偏差均小于4%。在纳豆发酵过程中生物胺总量范围在26.47～72.97?mg/kg之间,对人体不构成任何威胁。54?h时,纳豆激酶的酶活力达到最高,为（5?439.5±149）IU/g、活菌数为13（lg（CFU/g））,此时生物胺总量为（56.18±4.94）mg/kg。     

中式纳豆制备技术的研究

为探索出符合中国人口味且纳豆激酶酶活力高的中式纳豆加工技术,该研究从市售的4种纳豆中分离出4株纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）,并筛选出一株产纳豆激酶能力最强的菌株NK3。以牛奶培养基替代传统的种子液培养基培养纳豆菌种,通过单因素试验考察发酵温度、时间、接种量、加水量对纳豆激酶酶活力的影响,采用正交试验优化纳豆发酵条件。结果表明,以牛奶为培养基培养的纳豆菌生长良好,在发酵温度27 ℃、发酵时间1.5 d、接种量5%、加水量6%条件下,菌株NK3发酵制备出的纳豆无氨臭味,有淡淡的奶香味,且纳豆激酶酶活力高达668.5 U/g。     

传统调味品中纳豆激酶产生菌的筛选和鉴定

为开发符合中国人口味的纳豆,以传统调味品豆豉和豆酱为样品来源,筛选酶活高和发酵性状优良的纳豆激酶产生菌。分别利用牛奶平板和琼脂糖-纤维蛋白平板进行初筛和复筛;对筛出的菌进行纳豆激酶活性分析、纳豆制作及感官评价等。对性状优良的菌株进行形态观察、生理生化鉴定和16SrDNA序列分析等项目的测定;并对其培养基初始pH、发酵温度、盐离子构成等条件对酶活的影响进行单因素分析。结果共分离到15株具有纤溶活性的纳豆激酶产生菌,经计算,从中选出了4株高活力纳豆激酶产生菌(N-1,N-2,N-3,N-4菌株)。N-2菌株纤溶活性最高,其纳豆发酵性状最佳,纳豆拉丝长达80cm,其酶活达到1159U/mL,鉴定结果是该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。该菌最适的单因素液体发酵条件为:培养基初始pH 6.0,添加0.02%浓度的Ca2+盐,发酵温度35℃。在该条件下进行液体发酵,其酶活为1365U/mL,酶活比之前提高了18%。N-2菌株发酵性状优良,可用于纳豆制作。     

高产纳豆激酶地衣芽孢杆菌工程菌全合成培养基优化

以产纳豆激酶的地衣芽孢杆菌基因工程菌BL10（pP43SNT-SsacC）为出发菌株,开展其全合成培养基的发酵优化研究。通过单因素试验和正交试验优化了全合成培养基成分,获得了最优的培养基组成（g/L）：葡萄糖30、NaNO3 30、谷氨酸钠20、柠檬酸钠15、MgSO4·7H2O 0.5、K2HPO4·3H2O 1.5、CaCl2 0.5,pH 7.2。在优化的全合成培养基中,纳豆激酶最高酶活力达到25.59 FU/mL,相比于初始培养基发酵活性（4.27 FU/mL）,提高了5 倍。对比分析了全合成培养基和半合成培养基的发酵产物,结果表明,全合成培养基可显著提高纳豆激酶的纯度,与半合成培养基相比,纳豆激酶比活力提高了2 倍。本研究获得了纳豆激酶的全合成培养基成分,显著提高了纳豆激酶发酵活性,并进一步提高了纳豆激酶发酵纯度。     

纳豆激酶高活性菌株BN-05鉴定及发酵工艺优化

对分离的纳豆激酶高活性菌株BN-05进行了初步鉴定,并对其固态发酵产纳豆激酶的工艺条件进行了优化,旨在提高纳豆激酶的含量。通过形态和分子生物学鉴定BN-05为枯草芽孢杆菌属菌株,优化后发酵工艺参数:大豆破碎度为2,发酵温度为36℃,接种量为5.5%,葡萄糖添加量为2.5%。在优化条件下,BN-05通过固态发酵纳豆激酶活力达到(4 715.26±103.23)IU/g湿黄豆,比之前优化提高137%。     

纳豆激酶高产菌株的筛选及纳豆激酶的初步分离研究

从日本传统食品纳豆中筛选获得一株高产纳豆激酶的盐芽孢杆菌菌株,其产酶能力为227IU/g。该菌株经过固体发酵后获得含酶发酵物,采用硫酸铵分步盐析的方法对纳豆激酶进行了分离纯化,其沉淀物即纳豆激酶,经过分步盐析纳豆激酶的纯化倍数为1.34。     

低成本生产纳豆激酶工艺初探

以廉价的鲜豆渣为全组分探讨其生产纳豆激酶可行性,并与市售商品纳豆进行比较其活力。在单因素试验基础上,应用Box-Behnken中心组合设计原理,设计发酵温度、发酵时间及接种量三因素三水平响应面试验,建立回归模型。经响应面分析,回归模型具有较高拟合度。优化后的鲜豆渣固态发酵的工艺参数为:发酵温度36℃,发酵时间36 h,接种量8(mL/100 g),该条件下纳豆激酶酶活达到1 751.28 U/g。与商品化纳豆的纳豆激酶对比结果表明,除一个商品纳豆的纳豆激酶的活力与鲜豆渣发酵的纳豆激酶活力高以外,其余商品纳豆,同一品种的自制纳豆纳豆激酶的活力与鲜豆渣发酵的纳豆激酶活力无显著差异。全组分鲜豆渣作为纳豆激酶生产的原料,可以实现低成本、高品质产品开发。     

纳豆菌液态发酵谷物产纳豆激酶及发酵产物抗氧化活性研究

本文研究了纳豆菌液态发酵时间对纳豆菌生物量、蛋白酶酶活、纳豆激酶酶活的影响。在此基础上,研究添加四种谷物(糙薏仁、玉米、荞麦和糙米)对纳豆菌液态发酵产蛋白酶酶活、纳豆激酶酶活、谷物总酚迁移率、总酚残留率以及发酵产物抗氧化活性的影响。结果表明:添加糙米和荞麦可显著促进纳豆菌产蛋白酶(2444.19、1813.71 U/mL)、纳豆激酶(719.67、681.38 U/mL),且以荞麦为底物所产发酵产物的谷物总酚迁移率最高(0.64 mg/g干谷物)、抗氧化活性最强(30.37μmol trolox equiv/mL);采用浸泡蒸煮处理四种谷物、延长发酵时间可显著提高其发酵产物的蛋白酶酶活、纳豆激酶酶活、谷物总酚迁移率以及抗氧化活性。采用浸泡蒸煮处理荞麦,利用纳豆菌液态发酵其48 h,可制备富含纳豆激酶、谷物多酚、肽类物质且具有强溶栓、抗氧化活性的功能性食品。     

地衣芽胞杆菌工程菌高产纳豆激酶的发酵罐工艺优化及中试放大

以前期构建的产纳豆激酶的地衣芽胞杆菌工程菌BL10(p P43SNT-Ssac C)为研究对象,进行5 L发酵罐工艺优化及中试放大研究。考察了5 L罐转速、温度和p H对纳豆激酶发酵过程的影响,优化了发酵条件:转速500 r/min、发酵温度37℃、自然p H,纳豆激酶发酵活性达62.90 FU/m L,比初始发酵活性提高了94%。在此基础上,进行了葡萄糖和混合氮源补料发酵研究,确定了5 L罐的补料发酵工艺,当葡萄糖的补加速率为1.5 g/(L·h)时,生物量提高31%,纳豆激酶发酵活性达到71.23 FU/m L,比对照提高了13%。在50 L罐和300 L罐的中试放大实验中,纳豆激酶发酵酶活分别达到67.23 FU/m L和72.33 FU/m L,纳豆激酶发酵活性相对稳定,为纳豆激酶的工业化生产奠定了基础。     

产纳豆激酶菌株液体及固体发酵工艺初步研究

对纳豆菌株ZN-4(Bacillus natto)的液体深层发酵和固体浅盘发酵两种发酵工艺分别进行了初步研究,比较了两种工艺对该菌株产纳豆激酶的影响.结果表明,纳豆菌株ZN-4液体深层发酵的最佳培养基配方为:2%的葡萄糖,1%的大豆蛋白胨,Na2HPO40.6%,NaH2PO40.1%,MgSO40.05%,CaCl20.02%;最佳培养基起始pH为7.0,最佳接种量为3%,最适发酵温度为35℃,最佳发酵时间为56h,在此条件下,摇瓶发酵酶活最高可达到1903U/mL;以无机盐溶液浸泡过夜的优质东北大豆为发酵基料的固体浅盘发酵中,初步研究了不同接种量、发酵温度和发酵时间对该菌株产纳豆激酶的影响,结果表明,纳豆菌株ZN-4固体浅盘发酵的最佳接种量为10%,最适发酵温度为37℃,最佳发酵时间为48h,在此条件下,固体发酵酶活最高可达到2200U/g.     

纳豆芽孢杆菌发酵麸皮的抗氧化发酵条件研究

目的:为开发麸皮健康食品,考察了纳豆芽孢杆菌发酵麸皮的条件及清除自由基活性。方法:采用单因素和正交实验,以羟自由基清除率为衡量指标,对纳豆芽孢杆菌发酵麸皮的条件进行优化,体外实验测定麸皮发酵上清液和麸皮水提液清除·OH和O2-·的能力。结果:⑴以6%的麸皮为碳源,初始pH7.0、接种量2%、1%的蛋白胨为氮源、装瓶量25mL、温度为32℃、32h、140r/min时,纳豆芽孢杆菌发酵麸皮的·OH清除率最高;⑵体外实验表明麸皮发酵上清液和麸皮水提液均具有自由基清除率活性,其中麸皮发酵上清液对·OH和O2-·的IC50分别为8.2mg/mL和24.0mg/mL,比麸皮水提液分别高2.3倍和6.7倍。结论:实验表明,纳豆芽孢杆菌发酵麸皮能产生更强的抗氧化活力,在保健食品方面具有开发潜力。     

纳豆菌液态发酵荞麦产纳豆激酶及其代谢特性分析

对纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）液态发酵荞麦产纳豆激酶揺瓶、2.5 L发酵罐条件进行优化。对比自制大豆分离蛋白酶解物与商业大豆蛋白胨作为补充氮源时菌体生长规律以及代谢物质（酶、可溶性蛋白、还原糖、多酚及抗氧化物质）变化规律。纳豆菌液态发酵荞麦产纳豆激酶2.5?L发酵罐最优条件为荞麦浸泡6?h后,按料液比1∶10（g/mL）加水打浆,加入0.4%?α-淀粉酶,90?℃加热40?min,补充NS37071酶解12?h时所得酶解物,调节发酵培养基pH?7.0,接种量3%,通气量3.5?L/min,转速300?r/min,装液量1.2?L,发酵36?h。与商业大豆蛋白胨相比,补充大豆分离蛋白酶解物时,纳豆菌生长对数期较长,可溶性蛋白与还原糖的消耗量较大,在36?h趋于平稳,纳豆激酶活力持续上升至36?h达到最大值,酚类物质比溶出速率在12?h达到最大值,抗氧化物质比生成速率在6?h达到最大值。以荞麦为原料,补充自制大豆分离蛋白酶解物,通过优化纳豆菌液态发酵条件,可制备具有高纳豆激酶活力（152.5?FU/mL）、富含谷物多酚（0.109?mg/mL）且具有强抗氧化活性（27.43?μmol/mL）的发酵产物。     

纳豆芽孢杆菌的筛选与鉴定

纳豆是大豆经纳豆芽孢杆菌发酵制成的-种药食兼用的传统食品.本文以市售纳豆为原料,利用目标纳豆芽孢杆菌所应具有耐热性、显著的蛋白酶活性等生物学特性,筛选得到一株菌株.根据菌落形态和糖发酵、过氧化氢酶等生理生化试验,初步鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).实验表明,此株菌株具有产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)、产纳豆激酶的生理特性,从而证实了该菌株确实为纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto).     

纳豆激酶制剂的研究

以选取的纳豆菌-9号为出发菌株，在最佳摇瓶培养条件基础上通过5L发酵罐扩大培养，确定最优发酵培养条件，纳豆激酶活力较摇瓶培养提高2．05倍；发酵液经真空冷冻干燥得到纤溶活性较高的纳豆激酶干粉，并对纳豆激酶干粉的部分酶学性质进行了研究。     

花生粕固态发酵产纳豆激酶的工艺优化

探索纳豆菌固态发酵花生粕制备纳豆激酶的最佳工艺条件。以纳豆激酶活力为主要评价指标,在单因素实验基础上,通过正交实验优化花生粕固态发酵制备纳豆激酶的工艺条件。得出最佳发酵条件:发酵温度37℃,发酵时间24 h,接种量10%,料液比1∶0.4 g/m L。在此条件下测得发酵产物的纳豆激酶活力达到3162 U/m L,比单因素最高酶活提高了18%(2680 U/m L),可溶性氮含量为5.6 mg/m L,羟自由基清除率为74%,铁还原力的OD值为0.906。     

纳豆菌分离、鉴定及纳豆激酶高产菌株的正向选育

从日本纳豆食品中分离到1株枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis natto)Bs01-1菌株,根据纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶与蛋白酶活性的正相关关系,采用紫外线直接照射涂菌蛋白平板进行诱变育种的,成功地筛选到2株突变株MBS04-6和MBS04-9,其溶纤活性分别比出发菌株提高了87%和69%,达到4 179 IU/mL和3788 IU/mL。该法筛选菌株的正向突变率达到10%。     

纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶发酵工艺控制及纤溶酶分析

基于摇瓶发酵优化结果,在10 L发酵罐中研究了纳豆芽孢杆菌TN-02产纳豆激酶的发酵控制工艺,分析了发酵产物中纤溶酶的组分纯度。在放大发酵过程中,考察了培养温度和主要碳、氮源的流加补充对产酶的影响,并利用卡那霉素抗性基因kan对纳豆芽孢杆菌TN-02中的纳豆激酶基因aprN进行了部分替换和插入失活,获得了aprN突变的重组菌TN-021。结果表明,通过温度的阶段性控制和甘油、胰蛋白胨补料发酵,获得纳豆激酶的最高表达量为13 978.3 U/mL,是摇瓶发酵最高表达量的1.8倍;在菌株TN-021的摇瓶发酵产物中未检测到纤溶酶活力,证明了纳豆激酶是纳豆芽孢杆菌TN-02发酵产物中唯一纤溶酶。研究结果为纳豆激酶高水平发酵放大工艺控制奠定了基础,同时为纳豆激酶的品质分析方法提供参考。     

传统大豆发酵食品中纳豆芽孢杆菌的分离及纳豆发酵

以我国传统大豆发酵食品和稻草样品为来源,根据蛋白酶和纳豆激酶活性、产聚谷氨酸(poly-L-glutamic acid,γ-PGA)性能和生物素依赖特性进行筛选,分离获得了8株具有纳豆芽孢杆菌特性的枯草芽孢杆菌菌株。利用16S～23S rRNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列对分离菌株进行系统发育分析,结果显示其与已报道的纳豆芽孢杆菌菌株以较高的相似性(93%～97%)聚类一簇,独立于同种内的其他枯草芽孢杆菌。其中TC100和TC103菌株制作的纳豆粗酶液中的纳豆激酶活性最高,分别为550 U/mL和519 U/mL。HN48和TC100菌株发酵纳豆的感官效果最好,评价分数均为19分。综上所述,本研究根据纳豆芽孢杆菌特有的性状,有效分离获得了具有纳豆芽孢杆菌特性的8株菌株,通过菌株形态和ITS基因序列的系统发育分析确定分离菌株均属纳豆芽孢杆菌,8株分离菌株均能产纳豆激酶,发酵生产纳豆的感官效果良好,有望作为纳豆生产的工业菌株。     

纳豆激酶高产菌株的选育及固态发酵技术

以枯草芽孢杆菌为出发菌株,选用超声波和紫外线进行诱变处理,根据致死率、突变率与诱变剂量的关系选择合适的诱变剂量,以筛选高产纳豆激酶的优势菌株。实验表明：最佳诱变条件为：超声波45 kHz、280 W,时间60 min,紫外线照射距离30 cm,时间120 s。经多次初筛、复筛,选育出一株命名为BSCZ-4的优势菌株,其纳豆激酶酶活力为原始菌株的1.96 倍。对该菌种进行连续20 代培养,测得其溶解圈直径稳定在18～19 mm之间,表明该突变株遗传特性稳定。并采用Box-Behnken响应曲面法优化其固态发酵工艺条件,结果为：魔芋精粉添加量5%、接种量8%,34 ℃发酵24 h,纳豆激酶活力可达（4 087.83±93.75） U/g。