中国部分地区甲型肝炎病毒基因型分析

目的　分析中国部分地区甲型肝炎病毒 (HepatitisAvirus,HAV)的基因型。方法　采自辽宁 (LN1、LN2、LN3 )、上海 (Lu3 8)和云南 (YN)甲型肝炎病人的粪便标本共 5份 ,从中分离纯化HAV并提取病毒RNA ,以逆转录 半嵌套聚合酶链式反应 (RT hnPCR)合成VP1 2A交接区及VP1氨基端 ,经克隆筛选后进行测序分析。结果　所分离到的 5株HAV野毒株VP1 2A交接区 168个核苷酸 (nt)的片段与IB亚型的野毒株HM175比较 ,核苷酸差异 >7.5 % ;与IA亚型的日本野毒株AH1、AH2、AH3、FH1、FH2和FH3比较差异 <7.5 % ,因而均属IA基因亚型。但与IB亚型的野毒株MBB比较 ,LN1、LN3和Lu3 8在该区域的核苷酸差异 <7.5 %。进一步将LN1的VP1 2A交接区 3 3 9nt的片段、LN3和Lu3 8的VP1氨基端的核苷酸序列与MBB进行比较 ,核苷酸差异 >7.5 % ,表明这 3株HAV仍属IA基因亚型。结论　所分离到的HAV野毒株LN1、LN2、LN3、Lu3 8和YN均属IA基因亚型     

多表位DNA壳聚糖微球疫苗的体液免疫应答

目的研究多表位DNA壳聚糖微球疫苗的体液免疫应答。方法制备多表位DNA壳聚糖微球疫苗pcD-NA3.1-HME-3C3d,经鼻腔免疫小鼠,蛋白检测微孔试剂盒检测小鼠特异性IgG抗体水平。结果经免疫的小鼠均能产生针对各表位的特异性IgG抗体,DNA壳聚糖微球疫苗的抗体水平明显高于DNA疫苗。结论壳聚糖微球疫苗投递系统可提高多表位DNA疫苗的免疫应答效果。     

脊髓灰质炎病毒与痘苗病毒重组体的构建及表达

含脊髓灰质炎病毒1型(简称 PV1)全基因7.4Kb cDNA 和编码 PV1外壳蛋白 VP12.5Kb 的 cDNA 片段的两株重组痘苗病毒(RV-1和 RV-2)表达了 PV1抗原。经荧光标记的抗 PV1型特异性单克隆抗体检测,感染了 RV-1和 RV-2的 Herp-2细胞呈阳性荧光反应。免疫印迹实验证实两株重组痘苗病毒分别表达 PV1抗原三条和两条特异性蛋白带。免疫家兔后能诱导产生抗 PV1中和抗体。本文对重组病毒表达 PV1抗原的效率进行了初步讨论。     

乙肝乙脑麻疹多表位噬菌体微球疫苗的体液免疫应答

目的探讨乙肝乙脑麻疹多表位噬菌体微球疫苗的体液免疫应答效果。方法用壳聚糖制备乙肝乙脑麻疹多表位噬菌体微球疫苗,经腹腔、皮下和鼻腔3种途径免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性IgG抗体水平。结果3种途径免疫的小鼠均能产生针对各表位的特异性IgG抗体,鼻腔免疫效果最好;多表位噬菌体微球疫苗的抗体水平明显高于多表位噬菌体疫苗。结论壳聚糖微球疫苗投递系统可以提高多表位噬菌体疫苗的体液免疫效果。鼻腔免疫是多表位噬菌体微球疫苗的最佳免疫途径。     

噬菌体展示的1型糖尿病疫苗种子的稳定性

目的观察在不同温度保存条件下噬菌体展示的1型糖尿病疫苗种子的稳定性。方法将噬菌体展示的1型糖尿病疫苗种子样品分为两组,一组添加等体积的80%甘油,另一组不添加甘油,分别于不同温度条件下存放不同时间后取样,用噬斑法检测滴度。结果在37℃和25℃条件下保存,噬菌体疫苗种子滴度下降较快,在4℃和-20℃条件下保存噬菌体疫苗种子滴度下降相对较慢;37℃、25℃及4℃条件下保存,添加甘油并无明显的保护作用,而在-20℃条件下保存,添加甘油有明显的保护作用。结论噬菌体展示的1型糖尿病疫苗种子可在4℃条件下短期保存,-20℃条件下长期保存,并可添加甘油作为保护剂。     

甲型肝炎病毒(H2株)快速适应变异株全基因序列分析

目的 探索甲型肝炎病毒（Ｈ２株）细胞适应的分于机制。方法 将甲型肝炎减毒活疫苗毒株（ＨＡＶ Ｈ２Ｋ７）在人胚肺二倍体细胞ＫＭＢ１７上快速连续传代增强适应（１４ｄ）,检测连续传代后抗原滴度和感染性滴度,测定 第１８代（ＨＡＶ Ｈ２Ｋ７Ｐ１８）全基因组序列。结果 适应至第１８代抗原滴度达１：５１２,感染性滴度为７．５ＬｏｇＣＣＩＤ５０／ｍｌ。 整个基因组出现了１０个核苷酸突变,变异卒为０．１３％,变异较大区域位于５’末端非编码区（５’ＵＴＰ）,有３个核苷酸 变异。编码区７个交变,２个是无义突变,５个有义突变导致５个氨基酸变化,分别位于 ＶＰ２ Ａ－Ｓ;２Ｃ,Ｑ－Ｐ;３Ａ,Ｒ－ Ｃ;３Ｃ,Ｔ－Ａ和３Ｄ,Ｖ－Ｇ。结论 ＨＡＶ Ｈ２Ｋ７４因组５’ＵＴＲ、２Ｃ区、３Ａ区、３Ｃ区和３Ｄ区变异协同作用促进在 ＫＭＢ１７ 细胞上快速增强适应。     

冷冻干燥法制备1型糖尿病噬菌体展示疫苗

目的采用冷冻干燥法制备1型糖尿病噬菌体展示疫苗。方法将正交试验筛选的不同冻干保护剂与1型糖尿病噬菌体展示疫苗混合,优化冻干曲线进行冻干。检测冻干前后噬菌体疫苗的滴度,并通过各项指标对冻干后的疫苗进行评价。结果经筛选,最佳保护剂配方为:10.85%海藻糖+17.37%甘氨酸(w/v);最佳冻干曲线为:S1:-40℃4h,1.5℃/min;S2:-15℃5h,1.5℃/min;S3:25℃4h,1.5℃/min;真空度:0.02mbar。冻干后疫苗滴度下降不超过0.5pfu/ml,外观及电镜观察疫苗样品形态均较好,玻璃态转化温度能达到220℃以上,含水量小于3%。结论以海藻糖、甘氨酸为保护剂,采用冷冻干燥法制备的1型糖尿病噬菌体展示疫苗具有保护剂组成成分少、热稳定性强、含水量低、冻干曲线简化、保存时间长等特点。     

DNAzyme抑制H-ras基因表达的研究

目的研究DNAzyme特异切割H-ras mRNA的效率。方法针对H-ras mRNA序列,设计并合成了7个10-23DNAzyme,分别进行DNAzyme的细胞外酶切反应;通过荧光显微镜观察脂质体介导DNAzyme的转染效果,利用实时定量PCR、MTT法在细胞水平检测DNAzyme对H-ras基因表达的抑制。结果合成的7个10-23DNAzyme均可以细胞外近生理条件下对H-ras mRNA进行有效切割。利用LipofectamineTM可将荧光标记的DNAzyme No·1转染Hep-2细胞。转染后DNAzyme在细胞核及细胞质内均存在,且在细胞质中多位于核周围。实时定量PCR检测,DNAzyme No.1在转染后24h及48h能显著降低Hep-2细胞中H-ras RNA的含量,从而抑制ras基因的表达。利用MTT检测到DNAzyme No.1在转染Hep-2细胞24h及48h后对细胞增殖及分化均产生明显的抑制作用。结论DNAzyme在细胞内外均能够有效抑制H-ras基因的表达。     

壳寡糖佐剂对甲型肝炎病毒疫苗诱导小鼠体液免疫应答的影响

目的探讨壳寡糖(chitooligosaccharide,COS)佐剂对甲型肝炎病毒(hapatitis A virus,HAV)疫苗诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法将ICR小鼠随机分成9组:甲型肝炎减毒活疫苗Hep A-l 18 EU+不同剂量COS(100μg、500μg、1 mg、2.5 mg、5 mg、10 mg)组、阴性对照组(生理盐水)、抗原对照组(Hep A-l 18 EU)和铝佐剂对照组[Hep A-l18 EU+Al(OH)3200μg],每组6只,各组均经皮下注射ICR小鼠,200μl/只。于免疫后的第4、8、12和16周,采用间接ELISA法检测小鼠血清中抗-HAV特异性Ig G抗体水平。在实验期间,观察小鼠的健康状况,并于免疫16周后,取COS最佳剂量组及阴性对照组小鼠肾脏、脾脏、肝脏、肺脏、心脏组织,制备病理切片,进行对比观察。结果除阴性对照组外,各组小鼠免疫4周后均产生抗-HAV Ig G抗体,并随着时间的延长呈上升趋势,在第8周时均达峰值,随后逐渐下降;COS 2.5 mg、5 mg和10 mg组小鼠血清在各时期的抗体水平均显著高于抗原对照组和铝佐剂对照组(P0.05),且能维持较长时间,至16周抗体水平仍与铝佐剂对照组相当,差异无统计学意义(P0.05),其中COS5 mg组在整个试验过程中产生的抗体水平均最高,且与2.5 mg组峰值水平差异有统计学意义(P0.05),与10 mg组水平相当,至免疫后16周,COS 5 mg组与10 mg组抗体水平差异有统计学意义(P0.05)。COS最佳剂量为5 mg/只。试验期内,观察小鼠各项生理指标未见异常,COS 5 mg组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织均未观察到病变。结论 COS可显著增强HAV疫苗诱导小鼠的体液免疫应答,有望开发为一种可替代铝佐剂的新型佐剂。