pH值和盐浓度对金属螯合亲和层析分离人胰高血糖素样肽-1融合蛋白的影响

目的探讨pH值和盐浓度对金属螯合亲和层析(Immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)分离含His-Tag标签的人胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)融合蛋白的影响,并确定最佳洗脱条件。方法在0.50mol/L盐浓度条件下,分别取pH6.0、7.0、7.8和9.04种缓冲液进行咪唑梯度洗脱;在合适的pH值条件下,分别取氯化钠浓度0.25、0.50和0.75mol/L3种缓冲液进行咪唑梯度洗脱。分析在不同pH值及盐浓度条件下洗脱融合蛋白所需要的咪唑浓度及回收率。结果在所考察的pH值范围内,洗脱融合蛋白所需的咪唑浓度随洗脱液pH值的升高而逐渐降低,当洗脱液pH值为7.8时,融合蛋白的分离效果最佳,大部分杂蛋白被0～40mmol/L咪唑洗脱液去除且不含融合蛋白,而绝大部分融合蛋白在咪唑浓度达80～200mmol/L时被洗出,总回收率达(83.7±1.0)%,且比例较高;在此pH值条件下,氯化钠浓度达0.75mol/L,才会影响融合蛋白的回收率,氯化钠浓度为0.25或0.50mol/L的洗脱液洗出融合蛋白的效果相近;在pH7.8,含0.25mol/L氯化钠的洗脱体系下,用50mmol/L咪唑溶液洗脱杂蛋白,200mmol/L咪唑溶液洗脱融合蛋白,融合蛋白的回收率和比例分别可达(85.2±2.0)%和(80.5±1.0)%。结论在所考察的pH值和盐浓度范围内,提高洗脱液pH值和盐浓度均可降低洗脱融合蛋白需要的咪唑量,但也会降低融合蛋白的回收率。     

表达GLP-1融合蛋白的重组大肠杆菌分批补料培养工艺优化

人胰高血糖素样肽-1(Glucagon Like Peptide-1,GLP-1)是一种有潜在应用价值的治疗糖尿病的药物。今以一株表达GLP-1融合蛋白的重组大肠杆菌为研究对象,在分批培养条件下,通过流加甘油并在诱导前0.5h添加氮源使菌体密度、融合蛋白表达水平、融合蛋白体积得率和融合蛋白细胞得率分别提高了138.0%、29.5%、216.9%和29.6%。在此基础上,进一步考察了甘油补加策略、氮源补料方式以及补氮液浓度等过程因素对菌体生长以及GLP-1融合蛋白表达的影响,发现氮源流加过程是提高融合蛋白表达水平的关键因素。进而通过对补料过程的优化,建立了高密度高表达的分批补料培养工艺,最终使菌体密度、融合蛋白表达水平、融合蛋白体积得率和融合蛋白细胞得率分别达到51.93g·L-1、34.6%、2.937g·L-1和0.057g·g-1cell,较分批培养分别提高了314.5%、100.0%、784.6%和111.1%。研究结果对GLP-1融合蛋白的产业化开发有一定的指导意义。     

重组大肠杆菌HT02高密度高表达HT-1融合蛋白发酵过程优化

发酵工艺放大是将实验室成果产业化的必要一环,随着发酵规模的扩大,工艺流程也会有相应的调整,导致微生物所处的生长环境以及生长代谢状态的改变,从而影响大体积发酵罐的发酵水平。本文以一株产HT-1融合蛋白的重组大肠杆菌HT02为研究对象,在200 L发酵罐中研究了分批补料培养时菌体生长与HT-1融合蛋白表达的特性,通过采用提前诱导、增加接种量的手段,解决了因增加二级种子培养工艺而导致的200 L发酵罐中HT-1融合蛋白表达水平下降的问题,最终使菌体密度、HT-1融合蛋白表达水平、融合蛋白细胞得率以及融合蛋白体积得率分别达到55.1 g·L^-1、27.4%、0.056 g·(g cell)^-1和3.103 g·L^-1,较工艺改进前发酵水平分别提高了9.8%、23.4%、14.3%和25.2%,实现了在200 L发酵罐中高密度高表达发酵,为HT-1工业化生产提供了指导。