Pre-miR-10a重组腺病毒质粒的构建及其在K562细胞中的表达

目的构建pre-miR-10a(miR-10a前体)重组腺病毒表达质粒,感染K562细胞,并检测其基因表达水平。方法化学合成pre-miR-10a基因序列,克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,将构建正确的重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV pre-miR-10a与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183感受态细胞,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-pre-miR-10a,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒,经4轮扩增后检测病毒滴度。收集病毒后,以100 MOI感染K562细胞,RT-PCR法检测miR-10a基因的转录水平。结果重组腺病毒质粒pAd-pre-miR-10a经PacⅠ酶切,证明带有目的基因的重组腺病毒穿梭质粒已整合到腺病毒基因组中,4轮扩增后腺病毒滴度为1.5×1011pfu/ml,可高效感染K562细胞,感染效率达90%以上;重组腺病毒Ad-pre-miR-10a感染的K562细胞中miR-10a基因转录水平明显升高,过表达率为150.82%。结论已成功构建重组腺病毒表达质粒pAd-pre-miR-10a,并可在K562细胞中高效表达,为进一步从体内和体外水平研究其抗白血病效应奠定了基础。     

H_2O_2对Apg-2与BCR/ABL蛋白亚细胞定位的影响

目的观察H2O2对Apg-2与BCR/ABL蛋白亚细胞定位的影响。方法用50μmol/L H2O2分别处理BaF3-BCR/ABL、BaF3-MIGR1及过表达Apg-2蛋白的BaF3-BCR/ABL细胞,激光共聚焦显微镜观察细胞内Apg-2、BCR/ABL蛋白的亚细胞定位变化。结果 Apg-2和BCR/ABL蛋白在细胞中定位于胞浆,H2O2损伤可致Apg-2和BCR/ABL蛋白在BaF3-BCR/ABL细胞中发生核转位,Apg-2蛋白过表达可引起BCR/ABL蛋白核转位。结论 Apg-2蛋白在H2O2诱导的损伤后发生核转位,可能与BCR/ABL蛋白相互作用,保护H2O2诱导的细胞损伤。     

Apg-2过表达对BaF3-MIGR1及稳定表达BCR/ABL的BaF3-P210细胞增殖的影响

目的探讨热休克蛋白Apg-2过表达对小鼠pMIGR1空载体感染细胞BaF3-MIGR1和BCR/ABL转化细胞BaF3-P210(简称BP210)增殖的影响。方法构建pIERS2-EGFP-Apg-2真核表达质粒,电穿孔转染BaF3-MIGR1和BP210细胞,经G418筛选稳定表达细胞株,分别用RT-PCR和Western blot鉴定Apg-2的表达。采用Am-Blue法和流式细胞仪(FCM)检测Apg-2过表达对BaF3-MIGR1和BP210细胞增殖的影响,光镜观察细胞形态变化。结果pIERS2-EGFP-Apg-2真核表达质粒构建正确,转染细胞后筛选到稳定过表达Apg-2的BaF3-MIGR1-Apg-2和BP210-Apg-2细胞株,BaF3-MIGR1-Apg-2细胞的增殖速度明显低于BaF3-MIGR1细胞,BP210-Apg-2细胞比BP210细胞增殖加快。光镜下可见Apg-2过表达的两种细胞形态发生变化,瑞氏染色可见细胞核增多。结论Apg-2能够促进BCR/ABL阳性细胞的增殖,可能与慢性粒细胞白血病的发生发展相关。