环介导等温扩增技术快速检测椰毒假单胞菌的研究

建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测椰毒假单胞菌的方法.根据公布的椰毒假单胞菌16S～23SrRNA基因序列设计引物,建立了LAMP反应体系,在此基础上检测了蜡样芽孢杆菌菌液和人工污染蜡样芽孢杆菌的银耳样品,并将LAMP法与PCR法进行比较.结果表明,LAMP检测方法具有较高的特异性和敏感性,椰毒假单胞菌的检出限为5.4CFU/mL,是PCR方法检测灵敏度的1000倍,人工污染银耳样品中的椰毒假单胞菌的检出限为76CFU/g,样品中椰毒假单胞菌的检测过程(包括DNA提取、LAMP和电泳)可在2h内完成,因此LAMP可以简便快速有效地检测食品中的椰毒假单胞菌.     

改良LAMP快速检测酸土脂环酸芽胞杆菌的 研究

建立改良环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测酸土脂环酸芽胞杆菌的方法。以酸土脂环酸芽胞杆菌的16S r RNA基因保守区域设计4条特异性引物,优化反应体系,通过荧光曲线、琼脂糖凝胶电泳和白色沉淀判定扩增结果。同时,对LAMP引物特异性、灵敏度、检出限进行研究。LAMP法在61℃,60 min内完成酸土脂环酸芽胞杆菌的检测。2株酸土脂环酸芽胞杆菌呈阳性结果,17株非酸土脂环酸芽胞杆菌呈阴性结果,表明该种检测方法具有高特异性。检测纯菌灵敏度为7.2 CFU/m L,对人工污染苹果汁样品中酸土脂环酸芽胞杆菌的检出限是18 CFU/m L。LAMP法检测酸土脂环酸芽胞杆有操作简单、灵敏度高、特异性强等优点,应用前景广阔。     

FTA滤膜与环介导等温扩增技术结合快速检测消毒乳中的蜡样芽孢杆菌

目的:建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测蜡样芽孢杆菌的方法.方法:根据公布的蜡样芽孢杆菌溶血素基因的hblA基因的保守序列设计引物,将FTA滤膜提取DNA与LAMP法相结合,检测蜡样芽孢杆菌和人工污染蜡样芽孢杆菌的消毒乳.结果:LAMP方法检测灵敏度高,蜡样芽孢杆菌的检出限为4.4 cfu/mL,比PCR检测灵敏度高10倍;人工污染消毒乳中蜡样芽孢杆菌的检出限为57 cfu/mL.LAMP扩增可在20 min内完成,对消毒乳中蜡样芽孢杆菌的检测(包括DNA提取、LAMP和电泳)可在2 h内完成.结论:初步建立LAMP检测蜡样芽孢杆菌的快速检测方法.该方法灵敏度高、特异性好、耗时短.为食品中蜡样芽孢杆菌快速检测构建了一个技术平台.     

实时荧光环介导等温扩增技术检测猪肉中的假单胞菌

根据假单胞菌16S rDNA基因序列设计引物,并向反应体系中加入饱和型核酸染料Eva Green,利用实时荧光检测仪,建立假单胞菌属实时荧光环介导等温扩增技术(LAMP)。研究中对62株假单胞菌的16S rDNA基因通过DNAMAN软件进行序列比对后,针对共有片段设计扩增引物。对扩增体系进行了优化,优化结果经电泳鉴定。通过12株假单胞菌和23株非假单胞菌进行特异性验证,并比较了实时荧光LAMP与普通LAMP的灵敏度,对人工污染样品的检出限进行了测定。结果表明,特异性验证中12株假单胞菌为阳性,23株非假单胞菌为阴性。实时荧光LAMP检测纯菌的灵敏度为36 CFU/mL,是普通LAMP灵敏度的10倍。人工污染样品的检出限为1.73×10~3 CFU/g。本研究中建立了一种检测冷鲜猪肉中假单胞菌属的方法,实现了多个菌种的同时检测,避免了单一菌种检测的局限性,该方法快速、准确、灵敏度高,可在2 h内完成冷鲜猪肉中假单胞菌的检测。     

肉制品中蜡样芽胞杆菌实时荧光PCR检测方法的研究

根据蜡样芽胞杆菌肠毒素基因片段序列,用Primer express 3.0设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立蜡样芽胞杆菌实时荧光PCR检测方法。通过对梯度含量的蜡样芽胞杆菌标准菌液样品DNA和多种细菌的DNA进行实时荧光PCR检测,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。实验结果表明,只有蜡样芽胞杆菌产生扩增曲线,其他细菌无扩增,说明引物及TaqMan探针特异性较好,检测灵敏度为1×10~3CFU/m L。该方法具有很好的研究价值和应用前景。     

RF-LAMP技术检测鸡肉中小肠结肠炎耶尔森氏菌

本研究建立实时荧光环介导等温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法,扩增产物经电泳和酶切鉴定,表明扩增结果正确。本研究验证该方法特异性,对灵敏度和人工污染鸡肉的检出限进行测定。结果表明小肠结肠炎耶尔森氏菌株呈阳性结果,非小肠结肠炎耶尔森氏菌株均呈阴性结果。该方法检测纯菌的灵敏度为61 CFU/m L,人工污染鸡肉的检出限为46 CFU/g。该方法特异性强、灵敏度高、可实时检测小肠结肠炎耶尔森氏菌,能够实现对小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测。     

基于环介导等温扩增技术的产呕吐毒素 蜡样芽胞杆菌特异性检测

本研究旨在建立食品中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的快速检测方法。基于产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌合成酶基因cesB靶基因,设计4条特异性引物(2条内引物、2条外引物),建立环介导等温扩增技术(LAMP)。然后采用2株产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌、19株蜡样芽胞杆菌和41株非蜡样芽胞杆菌验证了该LAMP具有很好的特异性。LAMP检测的灵敏度在DNA水平上达到1.49 pg/μL,纯菌的灵敏度为5×10~3 cfu/mL。人工污染米饭样品,当起始污染量为2 cfu/g时,37℃增菌培养6 h,用试剂盒法和煮沸法提取的DNA,都可以检出产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌。采用此LAMP方法进行了72份实际样品的检测,检出2份产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌阳性样品,与传统方法一致。因此,本研究建立的LAMP检测方法可应用于食品中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的快速特异检测。     

3种常见食源性致病菌多重重组酶聚合酶扩增检测方法研究

目的建立了食品中沙门菌、单核细胞增生李斯特菌和蜡样芽胞杆菌多重重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification,RPA）快速检测方法。方法选择沙门菌invA基因、单增李斯特菌hlyA基因和蜡样芽孢杆菌16S RNA序列为目标基因进行扩增,建立并优化多重RPA扩增体系和扩增条件;评价反应体系的特异性和灵敏度,并对人工污染食品样品和实际样品进行检测。结果多重RPA反应体系能够在20 min完成三种目标基因的扩增,特异性强;对沙门菌、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的灵敏度分别为2.70×105、1.30×105、1.44×104 CFU/mL;能够用于人工污染样品和实际样品的检测。结论本研究建立的多重RPA等温扩增方法特异性强,操作快速、简单,为食源性致病菌的快速检测提供新方向     

实时荧光LAMP技术快速检测变形杆菌

建立一种快速检测变形杆菌的方法。采用实时荧光LAMP(Real Amp)技术检测变形杆菌,分析Gen Bank中公布的变形杆菌atp D基因序列,针对其6个区域设计4条引物,利用实时荧光监测仪等温(62℃)扩增模板DNA,通过与电脑相连进行实时监测,对该方法检测变形杆菌的特异性、灵敏度、人工污染猪肉检出限等方面进行研究,并将该检测法的灵敏度与普通环介导等温扩增(LAMP)检测法进行比较。结果表明,Real Amp检测方法比普通LAMP检测方法更加方便快捷,20 min内即可判定结果;用于特异性试验的19株试验菌株中,6株变形杆菌呈阳性结果,其他13株非变形杆菌均呈阴性结果;检测纯菌的灵敏度为8.1CFU/m L,是普通LAMP检测方法的10倍;人工污染猪肉的检出限为81CFU/m L。本研究建立的Real Amp检测方法操作简单,耗时短,特异性强、灵敏度高,能够实现对变形杆菌的快速检测。     

免疫磁珠——环介导等温扩增快速检测巴氏杀菌乳中蜡样芽孢杆菌的四环素耐药基因tetL

建立了免疫磁珠分离（IMS）结合环介导等温扩增（LAMP）检测巴氏杀菌乳中蜡样芽孢杆菌的四环素耐药基因tet L的方法。结果表明：经优化后,每微克链霉亲和素纳米磁珠与375 ng生物素标记的芽孢杆菌抗体偶联,在含有1×103 CFU/mL耐四环素蜡样芽孢杆菌的巴氏杀菌乳中,25μL免疫磁珠孵育1 h后,对蜡样芽孢杆菌BA117的捕获率为68.1%。该IMS-LAMP方法特异性高,2 h内对巴氏杀菌乳中耐四环素蜡样芽孢杆菌的检测灵敏度为24 CFU/mL。IMS-LAMP方法具有用时短,灵敏度高,操作简单等优点,可以有效检测巴氏杀菌乳中蜡样芽孢杆菌的四环素耐药基因。     

恒温实时荧光法快速检测奶粉中阪崎肠杆菌方法的建立

为实现奶粉中快速检测阪崎肠杆菌,本文建立了检测阪崎肠杆菌的恒温实时荧光法。针对阪崎肠杆菌16S r RNA设计三组LAMP引物,采用Deaou-308C恒温实时荧光检测平台,选取常见病原菌标准株进行引物特异性检测;选取阪崎肠杆菌标准菌株进行基因组DNA灵敏度和最低检测限测定,同时利用人工污染方式检测此方法在脱脂和全脂奶粉中的灵敏度和最低检测限,利用Real Amp法和国标法对20份市售奶粉进行对比实验。结果显示,引物组16S-11扩增效率最优,与常见病原菌无交叉反应,对阪崎肠杆菌基因组DNA、阪崎肠杆菌污染的脱脂和全脂奶粉的灵敏度分别达到102 CFU/m L、102 CFU/m L和103 CFU/m L;对阪崎肠杆菌基因组DNA和阪崎肠杆菌污染的脱脂和全脂奶粉的最低检测限分别达到103 CFU/m L、103 CFU/m L和104 CFU/m L;在20份市售奶粉样品中Real Amp检测结果与传统国标培养结果一致,表明本文建立的阪崎肠杆菌Real Amp检测方法适用于阪崎肠杆菌的快速检测。     

Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for detecting Listeria monocytogenes prfA in milk

A rapid and sensitive loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay was developed for detecting Listeria monocytogenes prfA in milk. The inclusivity of 23 L. monocytogenes and the exclusivity of 16 non-L. monocytogenes strains were both 100% in the assay. The limit of detection (LoD) of the LAMP assay in Listeria enrichment broth (LEB) was 2.22 CFU/mL after 12 h and 24 h of incubation. The LoDs of the LAMP assay in LEB with artificially contaminated milk (LEB-M) incubated for 12 h (2.22×10¹ CFU/mL) and 24 h (2.22 CFU/mL) were lower than those of the PCR and real-time PCR assays. Comparison of the LoDs in LEB with those in LEB-M showed that the LAMP assay was less influenced by the milk compounds than the real-time PCR assay. Our results indicate that the LAMP assay can be utilized as a potential screening tool for L. monocytogenes in milk.     

基于叠氮溴化丙锭与恒温核酸扩增技术快速检测亚致死状态食源金黄色葡萄球菌

建立一种将荧光染料叠氮溴化丙锭（propidium monoazide,PMA）与环介导等温扩增（loop-mediatedisothermal amplification,LAMP）技术相结合的方法,用于快速高效检测金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）。同时,采用人工污染金黄色葡萄球菌的速冻水饺和奶粉作为食品样品,研究PMA-LAMP方法的检测灵敏度。结果表明,PMA溶液质量浓度3 μg/mL,650 W卤素灯下曝光5 min,PMA能够完全抑制1.2×107 copies/mL金黄色葡萄球菌死菌核酸扩增。PMA-LAMP方法能够在恒温65 ℃、60 min内完成对亚致死型金黄色葡萄球菌特异性nuc基因的特异性检测,其对亚致死状态金黄色葡萄球菌的检出限为34 CFU/mL,对食物样品速冻水饺和奶粉的检出限分别为17 CFU/mL和1.70×102 CFU/mL。建立的PMA-LAMP方法可以有效检测亚致死态金黄色葡萄球菌,提供了一种新的检测技术和解决方案。     

可视化环介导恒温扩增法检测蔬菜产地环境灌溉水源中沙门氏菌

目的建立可视化环介导恒温扩增体系(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测灌溉水源中沙门氏菌的分析方法。方法以沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因序列设计特异性LAMP检测引物,优化LAMP反应体系和反应条件后,通过特异性实验、灵敏度实验对LAMP检测方法进行测试,并与国标检测方法对比检测人工污染的灌溉水源样品,验证该方法的准确性。结果灵敏度实验结果显示本LAMP检测方法最低检出限为7 CFU/25μL,特异性实验结果显示本LAMP检测方法具有良好的特异性,干扰菌株对本LAMP检测方法无影响。该方法在与国家标准检测方法对比,检测人工污染的灌溉水源样品时具有相同的准确性,检测灵敏度为1×10^2 CFU/mL。结论本研究建立了快速、准确、灵敏的恒温扩增体系,可以应用于灌溉水源中沙门氏菌的快速检测。     

实时荧光环介导等温扩增技术检测乳粉中的肺炎克雷伯氏菌

为了建立食品中肺炎克雷伯氏菌灵敏快速的检测方法,根据GenBank中已公布的肺炎克雷伯氏菌phoE基因设计引物,利用实时荧光监测仪,建立实时荧光环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术检测食品中肺炎克雷伯氏菌的方法,可直观判定检测结果,仪器亦可自动显示检测结果。对该检测方法的特异性、灵敏度等方面进行研究,并与聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法进行比较。结果表明,实时荧光LAMP检测方法特异性强、灵敏度高。用于特异性实验的21 株实验菌株中,4 株肺炎克雷伯氏菌,呈现阳性结果,而其他17 株非肺炎克雷伯氏菌,均呈阴性结果;检测纯菌的灵敏度和检测人工污染乳粉的检出限分别为79 CFU/mL和79 CFU/g,是常规PCR检测方法的100 倍。总之,本研究建立的实时荧光LAMP检测方法灵敏度高、特异性强、耗时短、结果判定直观,实现了对肺炎克雷伯氏菌的快速检测。     

实时荧光环介导等温扩增检测铜绿假单胞菌

目的建立一种实时荧光与环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)相结合的铜绿假单胞菌检测方法。方法利用铜绿假单胞菌的外毒素A基因(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A, PEA)序列,设计LAMP引物,对该方法的特异性、灵敏度及其在人工污染矿泉水中的检出限进行评价。结果该方法与其他菌株无交叉反应,特异性强,对纯菌液和人工污染矿泉水的检出限均可达到5.2 CFU/mL。结论该方法快速、灵敏、操作简便,为水样中铜绿假单胞菌的检测提供了一种有效的手段。     

IQ-Check Salmonella II Kit方法对食品中沙门氏菌检测的评价

通过对标准菌株和人工污染沙门氏菌的食品样品进行检测,评价IQ-Check Salmonella Ⅱ试剂盒方法。该研究采用试剂盒方法对50株不同血清型的沙门氏菌和50株非沙门氏菌进行检测,分析该方法的灵敏性和特异性;通过对人工污染沙门氏菌食品样品(包括液体奶、婴幼儿配方乳粉、肉及肉类制品)的检测,评价试剂盒方法与GB 4789.4-2016方法的一致性。实验结果表明:当菌浓度在10³ CFU/mL及以上,试剂盒方法对50株沙门氏菌实现全部检出,其对不同血清型沙门氏菌检出限的平均值为6.98×10² CFU/mL。试剂盒方法对50株非沙门检测结果均为阴性,说明试剂盒特异性较好。试剂盒方法与GB方法对人工污染沙门氏菌的食品样品阳性检出率分别为98.77%(161/163)和96.32%(157/163);相对准确度为:96%、99%、97%,总体准确度为97.33%;相对灵敏度为:96.22%、100%、100%,总体灵敏度为98.73%;相对特异性为:95.74%、98.15%、92.86%,总体特异性为95.80%。参照ISO 16140进行方法一致性分析,结果表明两方法在统计学上无显著性差异。该研究表明该试剂盒方法具有高灵敏性和特异性强的特点,在人工染菌食品样品检测中与GB方法呈高度一致性,值得在食品沙门氏菌快速检测中推广应用。     

婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌双重荧光PCR快速检测方法的建立

旨在建立针对阪崎肠杆菌的双重荧光PCR快速检测方法。以阪崎肠杆菌局部大分子合成(MMS)操纵子和外膜蛋白A(ompA)为靶基因,建立双重荧光PCR反应体系,探讨该体系的特异性、灵敏度和抗干扰能力。结果表明,双重荧光PCR体系对阪崎肠杆菌的灵敏度为4.3×103 CFU/mL,人工污染初始菌量为2 CFU/100 g奶粉样品增菌24 h即可检出;39株实验菌中的15株阪崎肠杆菌出现特异性扩增,24株非阪崎肠杆菌未出现特异性扩增。本研究所建立的双重荧光PCR体系特异好、灵敏度较高及抗干扰能力强,可用于婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌的快速检测。