罗汉果蛋白酶的贮存稳定性研究

将罗汉果蛋白酶粗酶以固态或液态在有光或避光、不同温度、不同浓度的半胱氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)和葡萄糖的条件下贮存,分别在不同时间测定粗酶的相对活力,以考察这些条件对罗汉果贮存稳定性的影响。结果表明:在这些条件下,60 d内,酶活都基本保持,但60 d后,酶失活速度加快。其中光和温度(-20℃～25℃)对罗汉果蛋白酶贮存稳定性的影响不明显,但加入半胱氨酸、EDTA或葡萄糖可减缓60 d后酶活下降的速度。所以罗汉果蛋白酶若在60 d内使用的可一般存放,若60 d后使用,可加入一定的半胱氨酸、EDTA或葡萄糖贮存,以保持其活性。     

HPLC-MS法测定罗汉果中6种罗汉果甜苷含量

利用高效液相色谱串联质谱(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS),分析比较不同产地罗汉果中6种罗汉果甜苷(11-氧-罗汉果皂苷V、罗汉果皂苷V、罗汉果皂苷IV、赛门苷I、罗汉果皂苷III E和罗汉果皂苷II E)的含量,同时利用该方法分析罗汉果甜苷提取和大孔树脂D101纯化过程中该6种成分的含量变化情况。样品经甲醇超声提取,色谱分离采用ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm),梯度进行洗脱,柱温25℃,流速0.5 m L/min。质谱分析采用电喷雾电离源(electrospray ionization,ESI),正离子模式检测。结果表明:6种甜苷在0.75 mg/L~9.00 mg/L范围内呈现良好的线性关系(r0.9975),检测限为0.38 mg/kg~1.28 mg/kg,平均加样回收率89.3%~105.6%。经分析测定发现,桂林市永福百寿乡适宜种植高品质罗汉果,利用大孔树脂D101可很好地进行罗汉果甜苷富集和纯化,同时利用的HPLC-MS方法,可为罗汉果种植和生产提供质量分析控制方法。     

气-质谱联用法测定罗汉果中有机磷农药残留

建立气相色谱-质谱联用法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)测定罗汉果中11种常用有机磷农药残留量的方法。样品经石油醚-丙酮(体积比2∶1)超声提取,提取物通过活性炭净化后选用HP-5MS毛细管柱对11种有机磷农药进行分离,GC-MS检测,外标法计算含量。11种有机磷农药在线性范围内(10μg/L~750μg/L),相关系数均大于0.999 0,检出限为LOD为0.432μg/L~3.901μg/L。样品3个加标水平(0.125、0.25、0.375μg/g)下,罗汉果中11种有机磷农药回收率均在83.3%~112.4%,相对标准偏差(RSD,n=6)为1.45%~8.28%。     

罗汉果蛋白酶的化学修饰

通过对罗汉果蛋白酶进行化学修饰,分析该酶结构与功能的关系。利用8种化学修饰剂对罗汉果蛋白酶进行修饰,并测定修饰后该酶的酶活的变化。结果显示:苯甲基磺酰氟(PMSF)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)和焦碳酸二乙酯(DEPC)对该酶的抑制作用很强,而其它修饰剂对酶活性影响不大,说明羟基、吲哚基和咪唑基可能为蛋白酶活性的必需基团,而巯基、氨基、羧基、胍基和二硫键可能并不是酶活性的必需基团。     

GC-MS法测定罗汉果中拟除虫菊酯农药残留量

建立气质联用(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)测定罗汉果中6种拟除虫菊酯类农药的残留量方法。样品用石油醚-丙酮混合溶剂超声提后过固相萃取小柱净化,经HP-5MS色谱柱分离,以气相色谱质谱法进行检测,用外标法计算含量。结果表明:6种拟除虫菊酯类农药在0.1μg/mL~1.0μg/mL范围内呈现良好的线性关系,相关系数为0.999 1~0.999 9,检出限为0.139μg/kg~5.262μg/kg。样品中3个加标水平的回收率为83.5%~106.1%,相对标准偏差(RSD)为0.9%~6.5%。本试验所建立的方法操作简便,具有良好的回收率,精密度和灵敏度,符合检测要求,可用于罗汉果中6种拟除虫菊酯类农药残留的测定。     

罗汉果蛋白酶的部分性质研究

对罗汉果蛋白酶的部分性质进行了研究。结果表明:罗汉果蛋白酶在220nm和280nm有明显紫外吸收;其粗酶在分子量为50～100ku范围内酶活占总的56%以上;该酶对酪蛋白水解能力强,对牛血清白蛋白和卵蛋白等水解能力弱;Cu2+和Tritonx-100对罗汉果蛋白酶有强抑制作用,而Fe3+、Mg2+和Na2B4O7.10H2O能明显激活酶的活性,其它所实验的金属离子和化学试剂对蛋白酶有部分抑制作用,或作用不明显。     

罗汉果蛋白酶的分离纯化和部分性质研究

对罗汉果蛋白酶的分离纯化和部分性质进行研究.利用硫酸铵盐析、离子交换和凝胶过滤柱层析对罗汉果蛋白酶进行了分离纯化,对纯化所得的酶进行了分子量和等电点测定.结果表明,纯化酶为电泳纯,回收率为4.2％,纯化倍数为31.1,凝胶过滤层析和SDS-PAGE电泳测得酶的分子量分别为40.3 ku和39.0 ku,等电聚焦电泳测得其等电点为8.55.