南方红豆杉多糖的含量测定及体外降血糖活性研究

采用水提醇沉法提取南方红豆杉多糖,硫酸-苯酚法测定多糖含量;采用HepG2细胞和α-葡萄糖苷酶作为体外受体模型,研究南方红豆杉多糖的降血糖效果.结果表明:南方红豆杉药材中多糖的含量为1.75％,无水葡萄糖在1.507～13.563 μg/mL内呈良好线性关系,平均回收率97.54％,RSD为1.60％;以二甲双胍和阿卡波糖作为阳性药,南方红豆杉粗多糖对胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗具有促进作用,对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制活性,粗多糖抑制活性(IC50 38.61 mg/L)明显高于阳性对照药(IC50 1081.41mg/L),且呈现剂量依赖性.     

刺激因子对桦褐孔菌胞外多糖体外降血糖活性的影响

桦褐孔菌液体深层发酵与子实体产多糖的体外降血糖活性存在较大差异,为提高前者的活性,本文研究了不同刺激因子作用下桦褐孔菌液体深层发酵产生的胞外多糖对正常HepG2细胞及胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响。结果表明：桦树浸提汁、VB1、VB6和白桦脂醇刺激下得到的发酵多糖在一定范围内均能促进细胞葡萄糖消耗,且不同刺激因子的体外降血糖活性促进效果不同。160 μg/mL桦树浸提汁组、40 μg/mL VB6组、80 μg/mL VB1组和白桦脂醇组发酵多糖均能显著提高胰岛素抵抗HepG2细胞48 h的葡萄糖消耗量,且效果均好于无刺激因子组,其中VB6的促进效果最显著,比无刺激因子组提高66.80%,显著高于阳性对照组（P<0.01）。结论：桦树中含有促进桦褐孔菌子实体产生活性多糖的刺激因子,桦树浸提汁中白桦脂醇、VB1和VB6能够提高桦褐孔菌液体深层培养产多糖的降血糖活性。     

青钱柳活性成分对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量及α-葡萄糖苷酶活性的影响

研究青钱柳多糖（CPP）和青钱柳黄酮（CPF）对胰岛素抵抗的人源肝癌细胞（IR-HepG2）葡萄糖消耗量及α-葡萄糖苷酶活性影响。用高浓度胰岛素诱导培养HepG2细胞,建立IR-HepG2细胞模型,将IR-HepG2细胞分为模型组、CPP高、中、低剂量组、CPF高、中、低剂量组和二甲双胍组,各组以相应药物孵育24 h,采用葡萄糖试剂盒测定细胞葡萄糖消耗量（ΔGC）,MTT法测定单位细胞葡萄糖消耗量（ΔGC/OD）;以阿卡波糖为阳性对照,比较不同浓度梯度的CPP与CPF对α-葡萄糖苷酶活性影响。与模型组比较,阴性对照组、二甲双胍组、CPP组与CPF组细胞?驻GC与ΔGC/OD显著性升高;不同浓度的CPP与CPF对α-葡萄糖苷酶均有抑制作用。提示青钱柳活性提取物降血糖功效与其提高细胞葡萄糖摄取量,抑制α-葡萄糖苷酶活性有关。     

桦褐孔菌菌丝体多糖提取工艺优化及其降血糖能力测定

以桦褐孔菌（Inonotus obliquus）菌丝体为试验材料,多糖提取率为评价指标,采用Box-Behnken 响应面法从提取时间、液料比和提取温度3 个因素优化桦褐孔菌菌丝体多糖的提取工艺,并研究粗多糖对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的影响。结果表明,桦褐孔菌菌丝体多糖的最佳提取条件为提取温度97 ℃、液料比51 ∶1（mL/g）、提取时间1.9 h、提取3 次,在此条件下多糖提取率为（8.02±0.45）%。体外酶抑制试验表明,桦褐孔菌菌丝体多糖浓度为10 mg/mL 时,对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率分别为（77.64±1.78）%和（39.20±1.17）%,二者的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）分别为3.07 mg/mL 和17.20 mg/mL,对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用明显,表明其具有较好的降血糖能力。     

紫色马铃薯花色苷改善HepG2细胞胰岛素抵抗模型糖代谢的机制

目的:观察紫色马铃薯花色苷对HepG2细胞胰岛素抵抗模型糖代谢的作用并对其机制进行初探。方法:以高浓度葡萄糖培养基为诱导因素诱导HepG2细胞建立胰岛素抵抗细胞模型,通过葡萄糖氧化酶法、四唑盐比色实验(MTT)和蛋白质印迹法(Western blot)检测紫色马铃薯花色苷对胰岛素抵抗细胞模型的葡萄糖消耗量、细胞存活率和胰岛素信号通路的蛋白表达的影响。结果:与空白对照组相比,当诱导培养基中葡萄糖浓度为50 mmol/L时吸光度的差值最大,所以选50 mmol/L的葡萄糖培养基来建立胰岛素抵抗细胞模型;花色苷的处理胰岛素抵抗细胞的浓度为40~100 μg/mL时,葡萄糖消耗量可高达19.55 mmol/L显著(p<0.05)高于模型对照组;花色苷浓度为40~100 μg/mL时细胞存活率基本上可以保持在80%,细胞毒性较小;花色苷可以调节因高浓度葡萄糖诱导而导致的IR、IRS-1、IRS-2水平下降的情况,降低p-IRS-1的表达水平,还可以阻止GLUT-2水平的降低。结论:紫色马铃薯花色苷可以改善HepG2细胞胰岛素抵抗模型的胰岛素信号通路抑制的情况,改善胰岛素抵抗模型的糖代谢。     

苦瓜皂苷对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响

采用高浓度的胰岛素诱导HepG2细胞出现葡萄糖代谢异常,从胰岛素的添加量和作用时间角度探讨建立胰岛素抵抗细胞(HepG2/IR)模型的最佳条件;分别设立阴性对照组、胰岛素抵抗模型组、盐酸吡格列酮阳性对照组以及苦瓜皂苷干预组(100、300、500、700μg/mL),利用葡萄糖测定试剂盒检测各组葡萄糖消耗量,同时MTT法评价苦瓜皂苷对HepG2/IR细胞活性的影响。结果表明,30μg/mL胰岛素诱导处理HepG2细胞36h是产生胰岛素抵抗的最适条件。与HepG2/IR模型组相比,300μg/mL的苦瓜皂苷不仅可以显著改善HepG2/IR细胞的葡萄糖消耗量,还能提高其细胞活性。     

富硒青钱柳多糖对α葡萄糖苷酶及HepG2细胞葡萄糖消耗的影响

以α-葡萄糖苷酶和HepG2细胞作为体外受体模型,研究富硒青钱柳多糖(Se-CPP)体外降血糖活性,并与青钱柳多糖(CPP)、CPP+硒酵母、CPP+亚硒酸钠复配物比较。结果表明,Se-CPP对α-葡萄糖苷酶活性具有良好的抑制效果且呈现明显的剂量依赖性,其半抑制浓度(IC₅₀)为0.054 mg/mL,低于阿卡波糖、CPP、CPP+硒酵母、CPP+亚硒酸钠复配物。适宜浓度的Se-CPP可促进胰岛素抵抗状态HepG2细胞对葡萄糖的消耗,效果显著优于CPP、CPP+硒酵母、CPP+亚硒酸钠复配物(p<0.05)。     

沙棘多糖对胰岛素抵抗HepG2细胞氧化应激的保护作用与机制

目的：研究沙棘多糖对胰岛素抵抗HepG2细胞氧化应激的保护作用与机制。方法：采用水提醇沉法对沙棘多糖进行提取,并用苯酚硫酸法测定多糖含量。CCK-8法测定不同浓度沙棘多糖对HepG2细胞活力的影响,用含5×10-8mol/L胰岛素的培养基诱导HepG2细胞24 h,建立HepG2细胞胰岛素抵抗模型。采用试剂盒测定葡萄糖消耗量以及糖原相对含量,并测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量,Western Blot法测定氧化应激相关蛋白的表达。结果：沙棘多糖含量为88.46%,在沙棘多糖质量浓度达到800 μg/mL时,细胞活力出现显著下降(P＜0.05),后续安全剂量选择400 μg/mL。经沙棘多糖处理后的葡萄糖消耗量以及糖原相对含量均显著提高(P＜0.05),SOD水平达到(79.31±2.16) U/mg,MDA水平达到(2.15±0.12) nmol/mg。沙棘多糖处理后显著提高Nrf2和HO-1的表达水平(P＜0.05),显著降低Keap1的表达水平(P＜0.05)。结论：沙棘多糖能够改善胰岛素抵抗细胞模型异常糖代谢情况和氧化应激水平,并通过调控Nrf2/Keap1/HO-1通路起到改善胰岛素抵抗的作用。     

红枣多糖的提取工艺及药理活性研究

本研究以红枣多糖得率为指标,在单因素实验的基础上,利用 Design-Expert8.0设计试验,采用响应面分析对红枣多糖超声辅助提取的条件进行了优化,随后以DPPH自由基、羟自由基清除能力为指标评价多糖的抗氧化效果、以α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率为指标证实红枣多糖具有降糖潜力,最后建立体外模型探究其降糖机制。首先对提取过程中主要影响多糖得率的水浴时间、料液比、超声时间和超声功率进行了单因素实验,同时利用响应面法进行优化分析。结果表明,红枣多糖最佳的提取条件为超声时间40 min,料液比1:20,超声功率80 W,水浴时间30 min,多糖得率达6.58%,与理论预测值6.71%一致。同时通过测定DPPH自由基、羟基自由基清除能力及还原力证实红枣多糖具有良好的抗氧化活性。此外,当多糖浓度达14 mg/mL时,对α-葡萄糖苷酶的抑制率为51.56%,而当浓度为4 mg/mL时对α-淀粉酶抑制率为28.43%,证实红枣多糖具有明显的降糖活性。在此基础上采用胰岛素抵抗HepG2细胞模型,以葡萄糖试剂盒测定及MTT法检测不同浓度的红枣多糖的葡萄糖消耗作用,结果表明当加药浓度为1.0 mg/mL时,细胞对葡萄糖的消耗量最大,GT/MTT达到模型组的154.2%。采用免疫印迹法（WB）检测胰岛素抵抗HepG2细胞中PI3K/Akt通路蛋白表达水平,确定红枣多糖可通过激活PI3K/Akt通路缓解胰岛素抵抗,发挥细胞保护作用。本研究对红枣多糖的提取方法进行优化,同时证实红枣多糖在体外具有抗氧化活性及降血糖活性,可作为一种潜在药食同源的抗氧化剂或功能性食品。     

马苏大马哈鱼籽营养成分分析及其卵磷脂对胰岛素抵抗的改善作用

从氨基酸组成、矿物质含量、维生素和卵磷脂含量等角度分析大马哈鱼（Oncorhynchus keta）和马苏大马哈鱼（Oncorhynchus masou）鱼籽的基本营养组成,并通过构建胰岛素抵抗HepG2肝细胞模型,以葡萄糖吸收水平为指标,研究马苏大马哈鱼籽来源的卵磷脂对HepG2细胞胰岛素抵抗的改善效果。结果表明：马苏大马哈鱼籽中的氨基酸、B族维生素和卵磷脂含量显著高于大马哈鱼籽,其中卵磷脂含量为234 mg/g,约占总质量的23%,是细胞膜的主要构成成分,具有多种生物学活性;二肽基态酶-Ⅳ活性抑制实验结果表明卵磷脂具有潜在的降血糖能力。模型组葡萄糖消耗量为3.87 mmol/L,显著低于正常对照组（5.86 mmol/L）（P＜0.05）,说明模型建立成功;与模型组相比,马苏大马哈鱼籽卵磷脂处理组均能够促进胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗,其质量浓度为800 μg/mL时,葡萄糖消耗量与空白对照组（5.86 mmol/L）接近,为5.60 mmol/L。采用实时荧光定量聚合酶链式反应测定胰岛素蛋白激酶B信号通路中关键酶基因的表达水平,卵磷脂降低胰岛素抵抗HepG2细胞中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸酶和糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β,GSK(3)β）基因的相对表达量,其中GSK(3)β相对表达量由模型组的2.60 倍下调至1.59 倍,增加了HepG2细胞中糖原合成酶基因表达水平,促进细胞内糖原合成,糖原相对含量从30.67%增加到73.00%,抑制糖异生过程的发生,改善了胰岛素抵抗HepG2细胞对葡糖糖的利用水平。     

响应面法优化桦褐孔菌多糖提取工艺及其抗氧化活性

利用超声波辅助技术研究桦褐孔菌多糖的最佳提取工艺,并对其抗氧化活性进行评价。在单因素试验基础上,以多糖提取率为指标,采用Box-Behnken响应面法优化超声辅助提取条件;采用三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)法纯化多糖后,通过DPPH自由基清除试验来评价其抗氧化活性。结果表明,桦褐孔菌多糖的最佳提取条件为:超声时间31 min,超声温度52℃,液料比为21∶1(mL/g),多糖提取率达到(3.81±0.19)%。桦褐孔菌粗多糖中多糖质量分数为19.0%(以葡萄糖计),蛋白质量分数为13.9%(以牛血清蛋白计)。体外抗氧化试验显示,桦褐孔菌精制多糖对DPPH自由基有一定的清除作用。     

桦褐孔菌黄酮类化合物的提取工艺优化及抗氧化活性

以桦褐孔菌为试材,采用乙醇热回流进行黄酮类化合物的提取,研究了单因素(料液比、提取温度、乙醇浓度以及提取时间)对桦褐孔菌中黄酮类化合物提取率的影响,通过正交实验对其提取工艺进行优化,利用FRAP、DPPH·、ABTS+·三种方法测定其抗氧化活性。结果表明:桦褐孔菌黄酮类化合物提取率影响因素为提取温度>乙醇浓度>提取时间>料液比,最佳工艺为提取温度75℃,乙醇浓度60%,提取时间2.0 h,料液比1:25 g/mL,在此工艺下提取桦褐孔菌黄酮类化合物含量为53.25 mg/mL,提取率为10.66%。桦褐孔菌黄酮类化合物浓度为200 μg/mL时,其总抗氧化能力相当于464.53 μmol/L FeSO₄。对DPPH自由基清除率的EC₅₀为36.44 μg/mL;对ABTS+自由基清除率的EC₅₀为299.89 μg/mL。研究表明桦褐孔菌中黄酮类化合物对DPPH·和ABTS+·的清除率接近V_C,具有较强的抗氧化活性,有潜力作为天然抗氧化剂推广应用。     

DEAE-52纤维素静态法分离纯化桦褐孔菌多糖的工艺优化

为了能高效快速的分离纯化桦褐孔菌子实体多糖,使用DEAE-52纤维素静态法,分别研究了静态吸附过程中多糖的样品浓度、吸附时间、吸附温度和吸附振荡转速等因素对多糖吸附量的影响及解吸过程中洗脱时间和洗脱液量对多糖解吸量的影响,确定了多糖分离纯化优化工艺条件。结果表明:多糖浓度为40 mg/mL时,在30 ℃,120 r/min转速下吸附处理90 min,此时DEAE-52纤维素对多糖吸附效果最好。而分别以12倍体积的去离子水洗脱90 min后,采用11倍体积的0.2 mol/L NaCl溶液洗脱60 min时,能达到最好的解吸效果,其中去离子水洗脱多糖浓度为0.56 mg/mL,0.2 mol/L NaCl洗脱多糖浓度为0.38 mg/mL。静态洗脱出的两种多糖组分均为分子量均一分布的多糖组分,与DEAE-52纤维素柱层析分离效果一致。因此采用DEAE-52纤维素静态法分离纯化桦褐孔菌子实体多糖是可行的。     

桦褐孔菌多糖对糖尿病肾病小鼠肾脏的保护作用

为探究桦褐孔菌多糖（Inonotus obliquus polysaccharide,IOP）对糖尿病肾病小鼠肾脏的保护作用。采用链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）诱导与高糖、高脂饲料喂养相结合的方式建立糖尿病肾病小鼠模型,将试验小鼠随机分为对照组、模型组、阳性组（盐酸二甲双胍）和桦褐孔菌多糖低、中、高剂量组。连续灌胃小鼠4周后,观察小鼠生长状态、测量小鼠体重,测定肾脏指数、肾功能指数以及肾脏抗氧化能力并对小鼠肾脏组织进行病理检测等。结果表明:桦褐孔菌多糖剂量组均能改善糖尿病肾病小鼠体重异常以及肾脏指数增高、肾脏肿大。其中高剂量组可以极显著抑制肾脏肿胀、修复肾组织损伤,提高肾脏氧化酶活力（P<0.01）,抑制丙二醛产生。桦褐孔菌多糖对糖尿病肾病小鼠肾脏的保护作用与多糖抑制小鼠机体过氧化损伤、减少脂质过氧化的合成有关。     

发酵桦褐孔菌对果蝇寿命及抗氧化能力的影响

研究桦褐孔菌深层培养条件以及培养基。并将培养得到的桦褐孔菌加入果蝇饲料,以基础饲料为对照,研究桦褐孔菌对果蝇寿命及抗氧化能力的影响。用加入不同剂量的桦褐孔菌饲料喂养果蝇,每3天记录果蝇死亡数,绘制生命曲线。通过测定不同饲养天数的果蝇体内主要抗氧化酶活力及脂质过氧化产物丙二醛含量,评价深层培养桦褐孔菌对果蝇抗氧化能力的影响。结果表明深层培养获得的桦褐孔菌可有效延长果蝇平均寿命,显著提高果蝇体内超氧化物岐化酶(SOD)及过氧化氢酶(CAT)活力,抑制丙二醛(MDA)的生成。可见,深层培养桦褐孔菌具有抗氧化能力和抗衰老的功能。     

桦褐孔菌多糖的分离纯化及其抗氧化活性测定

以桦褐孔菌为原料,测定其化学组分,并采用水提醇沉法提取桦褐孔菌粗多糖（IOP）。将获取的桦褐孔菌粗多糖进行脱蛋白、脱色素的初步纯化,然后利用DEAE-52纤维素层析柱及Sephadex-100凝胶柱对多糖提取液进行分离纯化,通过抗氧化活性筛选出活性较高的多糖组分,并通过高效液相色谱分析多糖组分的纯度。实验结果表明,桦褐孔菌子实体的化学成分组成丰富,其中多糖13.10%±0.31%、还原糖4.21%±0.40%、蛋白质2.70%±0.71%、灰分9.60%±0.31%。通过对桦褐孔菌粗多糖脱蛋白、脱色素的试验方法进行筛选,得到聚酰胺层析法为最佳的脱除方法。蛋白质的脱除率为93.1%、脱色率为75.8%,多糖的保留率为90.3%。IOP经过DEAE-52纤维素柱层析后得到四个单糖组分:IOP-1、IOP-2、IOP-3、IOP-4。对四个多糖组分进行抗氧化实验发现,IOP-2对DPPH自由基的清除率最高,清除率为81.9%。IOP-2经过Sephadex-100层析柱后获得两个多糖组分:IOP-2a、IOP-2b。对比其抗氧化活性,筛选出活性较高的多糖组分为IOP-2a。采用高效液相色谱法鉴定多糖组分IOP-2a,只检查出一个对称峰,说明IOP-2a为均一性多糖。     

桦褐孔菌子实体与菌丝体营养成分比较分析

将液体培养的菌丝体与野生子实体烘干磨粉处理,对其营养成分测定分析,结果表明：菌丝体粗多糖含量（7.43 g/100 g）显著高于子实体粗多糖含量（2.31 g/100 g）,二者均由果糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖7 种组成;凯氏定氮法测得子实体粗蛋白含量为6.69 g/100 g,菌丝体粗蛋白含量为21.08 g/100 g;全自动氨基酸分析仪测得子实体含14 种氨基酸,菌丝体含16 种氨基酸;原子吸收分光光度计测得桦褐孔菌中含有大量K、Fe、Ca、Zn、Mg元素,少量Na、Mn、Se。研究结果表明桦褐孔菌的菌丝体营养成分比较丰富,可以代替子实体应用于食品及药品行业中,缓解子实体这种珍稀野生资源的不足。