贵州烟草上一株PVY坏死株系全序列测定与分析

2007年从贵州省贵定烟区采集一株呈典型马铃薯Y病毒坏死株系(Potato virus Y vein necrosis strain,PVYN)的烟草病毒病样,经PVY鉴别寄主枸杞(Lycium barbarum L.)单斑分离纯化后,于枯斑三生烟(Samsun NN)株上保存,得到PVY分离物Guiding-3。以GenBank中已有的PVY全序列为基础,设计了3对PVY特异引物。通过总RNA提取、RT-PCR及序列测定,发现所测得的PVY分离物Guiding-3全长基因组序列(NCBI登录号为HM590405)包括9 699个碱基,整条序列仅包含一个由9 186个碱基组成的开放读码框(ORF),编码一条包含3 061个氨基酸的多聚蛋白。利用MEGA软件对所测得的PVY全序列与GenBank中已有的PVY全序列进行系统进化分析,发现Guiding-3分离物的序列与PVYN、PVYNTN、PVYN:O、PVYO、PVYNNP株系的一致性分别为98%、97%、94%、92%、85%,在已有的PVY株系中,Guiding-3分离物与PVYN株系具有较高的进化亲缘关系。另外,还对PVY的分子变异进行了初步讨论。     

苦荞麦主要过敏蛋白N端基因片段的克隆及序列分析

为了获得苦荞麦主要过敏蛋白全长基因并深入开展苦荞过敏蛋白的研究,本实验在先前获得的苦荞麦主要过敏蛋白C端(TBa)基因序列的基础上,设计不同的引物,以开花20d左右的苦荞麦果实为材料提取总RNA,并以此RNA为模板,通过RT-PCR和5’-RACE等方法,扩增,克隆获得苦荞麦主要过敏蛋白N端(命名为TBb)cDNA序列。序列分析结果表明,该序列由1005bp组成,开放阅读框为960bp,可编码一个由320个氨基酸残基组成的功能蛋白。同源性分析显示,此核苷酸序列与甜荞麦过敏性贮藏蛋白及豆球类蛋白的同源性达到90%。由此核苷酸序列推导出的氨基酸序列与甜荞麦13S贮藏蛋白有84%的同源性,与甜荞麦主要过敏蛋白有76%的同源性。苦荞麦主要过敏蛋白N端基因的获得为该蛋白的重组表达及其生物学活性等研究建立了前期基础。     

福寿螺(Ampullaria crossean)mfc 基因的分子克隆和序列分析

目的:从福寿螺胃组织细胞中扩增多功能纤维素酶基因,与pGEM T-easy载体连接,转化大肠杆菌删DH5 a.结果:该基因全长为1 225 bp,上游5'端非翻译区19 bp,3'端非编码区21 bp,开放阅读框(0pen reading frame,ORF)1 185bp,编码395个氨基酸,推测等电点pI为6.57,分子质量45.8k Da.推测的多功能纤维素酶具有糖苷水解酶保守的氨基酸序列,属于糖苷水解酶第10家族.同源性比对结果显示,该基因及推测的氨基酸序列与egx(GenBank Accession No.AAP 31 839)的同源性分别为99.3%和99.8%,在8个位点出现核苷酸差异.在1个位点出现氨基酸差异.通过软件分析并预测,该基因编码的蛋白共存在14个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点.没有信号肽序列.结论:成功克隆出福寿螺多功能纤维素酶基因.     

烤烟八氢番茄红素合成酶基因的克隆与序列分析

利用同源性克隆方法,从烤烟栽培品种K326(Nicotiana tobacum K326)中克隆获得烤烟八氢番茄红素合成酶基因的全长cDNA序列(命名为T-psyl),GenBank中的登录号为HM345582,该基因全长为巧21 by,编码的蛋白含441个氛基酸,蛋白登录号为ADK25054,Blast搜索结果及进化分析结果表明,该基因序列与观赏烟草、番茄和辣椒的八氢番茄红素合成酶基因同源性分别为95%,91%,86%.其编码蛋白与观赏烟草、番茄、牛奶子的PSY基因编码蛋白一致率分别为97%,90%和74%.     

烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与生物信息学分析

利用同源克隆和电子克隆方法,从烤烟栽培品种韭菜坪2号(Nicotiana tobacum cul.Jiucaiping2)中克隆获得烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶(zeta-carotene desaturase,ZDS)基因的全长cDNA序列(命名为T-zds1),并对其编码蛋白的一级、二级进行了预测。该基因在GenBank中的登录号为JF975566,全长为2312 bp,编码的蛋白含588个氨基酸,蛋白登录号AEG73891。BLASTp搜索结果及进化分析结果表明,烤烟T-zds1基因编码氨基酸序列与番茄、向日葵、胡萝卜ZDS基因编码氨基酸序列的相似性分别为97%,92%,90%。     

牛凝乳酶全长cDNA的克隆及其原核表达载体的构建

从小牛皱胃中提取凝乳酶(Chymosin)总RNA,经过RT-PCR获得凝乳酶cDNA,纯化后与pMD-18T载体连接,转化大肠杆菌JM109,通过双酶切和序列测定,获得了凝乳酶全长基因序列。序列测定表明,凝乳酶全长核苷酸长度为1 143 bp,编码381个氨基酸。与GenBank上已发表序列NM_180994进行比较,核苷酸同源性为99.56%。将该基因片段克隆到原核表达载体pET-22b中,构建重组质粒pET-22b/Chymosin,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为凝乳酶的进一步表达奠定了基础。     

陕西烟区烟草脉带花叶病毒外壳蛋白基因的克隆和原核表达

根据烟草脉带花叶病毒(TVBMV)CP序列合成上下游引物,利用RT-PCR方法获得了(TVBMV)CP基因。序列分析表明,TVBMV CP基因全长813nt,编码271个氨基酸;与GenBank中已报道的9个分离CP基因相比,其核苷酸及氨基酸序列同源性分别为90.28%-98.15%和97.05%-100%。将TVBMV CP基因经BamHI/NotI双酶切定向插入到pET30a载体中,构建了原核表达载体pET30-TVBMV CP,重组质粒经BamHI和NotI双酶切鉴定及基因测序验证正确后,用IPTG进行诱导表达。结果表明:TVBMV CP在大肠杆菌中获得了高效表达,表达产物的分子量为37 kD。用表达产物为抗原免疫家兔制备了特异性抗血清,其效价为1/2048。用Western-blot检测田间样品,其结果表明,制备的抗血清可用于检测田间的发病植株。     

芝麻黄花叶病病原的分子鉴定

从芝麻黄花叶病株上分离得到花生条纹病毒2个分离物（Peanut stripe virus sesame isolate,PStV-sel和PStV-se2）。提取感病芝麻叶片的总RNA,RT-PCR扩增外壳蛋白基因（cp）片段。序列测定结果显示,印基因含有861个核苷酸,编码分子量为32．4kDa的蛋白。2个株系cp基因与PStV其它株系核苷酸序列一致性为94．4％～99．9％,氨基酸序列一致性为93．7％～100％。株系间CP氨基酸序列系统进化树结果表明,芝麻PStV分离物与中国其它寄主来源的PStV株系处于同一进化分支。     

山参磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶cDNA克隆及序列分析

磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)具有明显的抗氧化活性,避免细胞膜受到过氧化损伤。本研究利用RACE技术,克隆出山参phgpx基因全长c DNA。序列分析表明:该克隆片段全长490 bp,编码162个氨基酸,有3个真核生物PHGPx特有的保守亚结构域。该片段编码的蛋白为跨膜亲水性稳定蛋白质,与柑橘、蓖麻等PHGPx氨基酸序列同源性分别为76%和75%。同时建立了9种植物的系统进化树。     

甘油脱水酶结构基因(gldABC)克隆及序列分析

以肺炎克雷伯氏菌As1.1736的基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到了目的基因(gldABC)并将该基因克隆到pMD19-TSimple载体。通过对该基因的序列分析,甘油脱水酶(gldABC)结构基因的全长为2816bp,由三个独立的开放阅读框架组成,三个独立的读码框分别由1668、585、426bp组成,分别编码556、195、142个氨基酸。通过BLAST同源性分析,该基因与GenBank中已发表的gldABC基因(U60992)的核苷酸序列同源性为99.39%。氨基酸的同源性为100%。     

苦荞和甜荞二氢黄酮醇4-还原酶基因（Dfr）的克隆及序列分析

采用同源基因克隆的方法,以苦荞和甜荞叶片为材料,提取总RNA,经RT-PCR 扩增获得其二氢黄酮醇4- 还原酶基因(dfr)cDNA 序列,并通过T 载体克隆后测序。序列分析表明,获得了苦荞和甜荞dfr 的全长cDNA编码序列,其1026bp 的全长开放阅读框(ORF)均编码341 个氨基酸,并具典型的dfr 结构特征和功能模块。同源性分析显示,苦荞和甜荞与其他植物的dfr 基因核苷酸相似性为71%～98%;根据氨基酸序列构建系统进化树表明,二者与豆科、桑科和蔷薇科聚为一类。     

芝麻主要过敏原油质蛋白的基因克隆和原核表达

为克隆黑、白芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins的基因并在原核细胞中对其进行表达,本研究分别提取黑、白芝麻的总RNA,逆转录合成cDNA,根据序列设计简并引物,扩增芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins基因的完整开放阅读框,并与pET-28a载体连接,测序鉴定后转化大肠杆菌E.coliBL21（DE3）及用IPTG诱导表达。结果表明克隆获得黑、白芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins的全长基因约为438bp的开放阅读框（包括终止密码子）,编码145个氨基酸。所编码的蛋白相对分子质量约为15.5kDa,为小分子量蛋白,等电点为5.18,与理论值相符。序列同源性分析发现其与数据库中已知的黑、白芝麻油质蛋白Oleosins基因同源性很高（GenBank黑、白芝麻油质蛋白基因登录号分别为EU999158和EU999159）,并在DE3中高效表达。     

玉米谷氨酰胺转胺酶基因的克隆及原核表达

从玉米嫩叶中提取总RNA,通过RT-PCR的方法扩增出玉米谷氨酰胺转胺酶(TGase)全长基因,回收目的片段并测序,该基因编码区全长1605bp,编码535个氨基酸残基,分子量为60.9kD,与GenBank(登录号：AJ421525)上已发表的序列同源性为100%。按正确的阅读框架将玉米TGase基因片段定向克隆到表达载体pET-28a上,将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株,1mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,经凝胶分析软件测得蛋白表达量约占总蛋白的15%,以His-Tag抗体作为一抗,采用Western-blot方法检测目的蛋白,结果证明所表达的特异蛋白是带有His-Tag的重组融合蛋白,利用Ni2+-NTA琼脂糖树脂亲和层析柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE鉴定为单一条带,测得纯化后的TGase酶活力达到16U/mg。     

烟草PVYN辽宁分离物全序列测定与分析

利用引起烟草脉坏死病的马铃薯Y病毒脉坏死株系辽宁分离物（Potato virus Y-vein necrosis strain Liaoning isolate, PVYN-LN）,以GenBank中已有的PVY全序列为基础,设计特异引物。通过总RNA提取、RT-PCR、3’RACE和5’RACE扩增及序列测定,测得PVYN-LN全长基因组序列（NCBI登录号为JQ971975）包括9714个碱基(含PolyA尾),整条序列仅包含一个由9186个碱基组成的开放读码框（ORF）,编码一条包含3061个氨基酸的多聚蛋白。对所得序列进行BLAST,利用MEGA软件对所测得的PVYN-LN全序列与GenBank中已有的PVY全序列及氨基酸进行系统进化分析,发现PVYN-LN分离物与已报道的PVYN株系具有较高的进化亲缘关系,该分离物属于PVYN株系。序列重组分析软件RDP4分析,该序列无重组。     

菠菜亚硝酸还原酶(NIR)基因的克隆与生物信息分析

利用RT-CR方法克隆菠菜NiR基因,并利用ExPASy分析预测了其编码蛋白。结果表明,该NiR基因(登陆号:X07568)全长为2062bp,1785bp开放阅读框,编码一个包含594个氨基酸残基的多肽链。所推导的氨基酸序列与拟南芥、小麦编码的氨基酸序列具有较高同源性,为85%。     

烟草叶片表面抗性蛋白T-phylloplanin基因的克隆

从烟草突变体T-cldf叶片表达基因的SSH文库中,筛选到一个与真茵抗性相关的表达序列标签P1T10(GenBank Access No.EBl02896).以P1T10序列为模板设计引物,用末端快速扩增(RACE)技术扩增得到T-Phylloplanin的cDNA全长(GenBank Access No.DQ451214).利用DNA STAR软件的EditSeq程序(Version 5.01)分析T-Phylloplanin基因,显示它包含一个完整的开放读码框,编码一个含有110个氨基酸、等电点为7.74、分子量为11.3 kD的小分子量蛋白(GenBank Access No.ABE03627).通过BLAST比对发现它与烟草叶片的一个表面抗性蛋白全长基因(GenBank Access No.AY705384)的同源性为93%.通过半定量RT-PCR分析表明,T-Phylloplanin在烟草突变体T-cldf叶片中的表达量高于烟草K346.     

黔南烟草马铃薯Y病毒(PVY)株系的分子鉴定

为了揭示贵州省黔南烟区马铃薯Y病毒(PVY)株系分布及分子变异规律,先利用血清学方法初步鉴定PVY株系,再选择19个PVY分离物进行分子鉴定.结果表明,克隆的19个PVY cDNA片段全长均为1074 nts,包含1个801 nts的完整cp基因,编码266个氨基酸.序列比对发现,19个黔南PVY分离物cp基因核苷酸序列相似性为87.0％ ～ 99.9％,与GenBank登录的其他17个PVY株系cp基因序列相似性为86.6％ ～ 99.9％.系统进化树分析表明,黔南烟区19个PVY分离物中,有3个PVY分离物与PVYN株系和PVYNTN亲缘关系较近,而其他16个PVY分离物与PVYNN:O株系的亲缘关系最近.     

烟草法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及序列分析

采用逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,以烟草品种K326叶片总RNA为模板扩增出烟草法呢基焦磷酸合酶基因fps,克隆至载体PMD19-T中。序列分析表明,所克隆的cDNA序列全长702 bp,共编码234个氨基酸残基,其核酸序列与玉米、杜仲、拟南芥、青蒿、Nicotiana sanderae×Nicotiana langa-dorffii杂交种的法呢基焦磷酸合酶基因的核酸序列同源性分别为74%,76%,77%,80%和97%。     

苦荞过敏蛋白全长基因的克隆、表达及免疫学活性研究

荞麦属于一种常见的植物性过敏原。本实验在以往研究的基础上,以苦荞种子总RNA 为模板,通过RTPCR和5'-RACE 等方法,扩增、克隆获得苦荞过敏蛋白全长cDNA 序列。分析表明,该序列编码一个由515 个氨基酸残基组成的功能蛋白,并与甜荞过敏性贮藏蛋白的氨基酸序列同源性达到90% 以上。经原核表达及一步亲和纯化后得到纯度较高的重组苦荞过敏蛋白(rTBt)。采用竞争性ELISA 对其免疫活性分析显示,目的蛋白与荞麦过敏病人血清中的IgE 抗体可以特异结合。