全基因组测序分析2018年江西省临床分离非伤寒沙门菌耐药性研究

目的 掌握2018年江西省食源性疾病病例的非伤寒沙门菌分离株的耐药特征、耐药表型与耐药基因之间的对应关系,评价全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)技术在耐药监测的应用前景。方法 本研究以2018年江西省食源性疾病病例分离的58株非伤寒沙门菌为研究对象,用微量肉汤稀释法检测菌株对14种抗菌药物的耐药性,对58株非伤寒沙门菌进行WGS,拼接后的序列经过与ResFinder数据库比对,注释耐药基因。结果 58株非伤寒沙门菌对四环素耐药率最高(77.59%,45/58),其次是氨苄西林(72.41%,42/58),对亚胺培南全部敏感。耐3类及3类以上抗生素的多重耐药菌株占56.90%(33/58),最高为6重耐药菌株占3.45%(2/58)。58株非伤寒沙门菌共筛选出47种11类耐药基因,喹诺酮耐药决定区(quinolone resistance-determining region, QRDR)存在gyrA、gyrB和parC基因突变。菌株对氨基糖苷类耐药基因携带率最高为100.00%(58/58),其次是四环素类耐药基因 携带率为72.41%(42/58),大环内酯类耐药基因携带率最低为3.45%(2/58)。携带3类及3类以上耐药基因的菌株占77.59%(45/58),1.72%(1/58)菌株最高携带9类耐药基因。58株非伤寒沙门菌的药敏试验结果与检测出的已知耐药基因总体符合率达93.43%(611/654)。除喹诺酮类外,其他类别的抗生素耐药表型与耐药基因符合率均高于91%,部分种类的抗生素耐药表型与基因符合率达100%。结论 非伤寒沙门菌耐药现象较为严重,其耐药表型与耐药基因有很高的一致性,WGS可作为预测沙门菌耐药性的有效手段。     

鼠伤寒沙门菌多重耐药性机制研究进展

AcrAB外流泵系统的过度表达和拓扑异构酶基因突变是导致鼠伤寒沙门菌产生多重耐药性 (MAR)的重要原因。AcrAB外流泵系统的合成有多重耐药调节子 (marRAB)调控 ,AcrAB与多种抗生素的耐药有关。拓扑异构酶 (topoisomerase)的突变主要与氟喹诺酮类药物的耐药性有关 ,突变主要发生在gyrA ,parC基因上     

动物性食品源大肠杆菌质粒介导喹诺酮的耐药机制研究

本研究以动物性食品源大肠杆菌为研究对象,采用琼脂二倍稀释法调查菌株对抗生素的药物敏感性,通过PCR扩增及产物测序检测质粒介导喹诺酮耐药(PMQR)基因的分布以及喹诺酮耐药决定区(QRDR)靶基因突变,旨在更好的了解食源性大肠杆菌对喹诺酮类药物产生耐药性的分子机制。645份动物性食品样品中共检出大肠杆菌179株,总检出率为27.7%。179株动物性食品源大肠杆菌对15种抗生素均表现出不同程度的耐药性,其中对四环素、链霉素、萘啶酸和复方新诺明的耐药水平较高。PMQR基因阳性菌株共14株,占受试菌株的7.8%,其中有11株能通过接合转移将PMQR基因转移至受体菌中。QRDR靶位突变在PMQR阳性菌株中普遍存在,介导菌株对喹诺酮的高水平耐药。研究结果表明,动物性食品可能成为耐药菌株的潜在"蓄水池",并通过食物链将耐药性传递给人类,从而引起人类的感染以及耐药菌株的流行。     

鸡肉源沙门氏菌对(氟)喹诺酮类抗生素的耐药性及相关基因

目的:研究分离于广东、广西、福建和上海4省(市)零售鸡肉源沙门氏菌对萘啶酮酸和部分氟喹诺酮类抗生素的药敏性及相关耐药基因,以更好地了解耐药性的产生和传播途径,确保食品安全。方法:使用临床和实验室标准协会推荐的琼脂稀释法测定沙门氏菌的药敏性,用PCR、基因序列测定和基因库在线比对方法确定耐药沙门氏菌中与(氟)喹诺酮类抗生素耐药相关的gyr A亚基中喹诺酮类抗性决定区,par C亚基中的氨基酸突变状况以及qnr质粒携带的与喹诺酮类抗生素耐药相关基因。结果:358株沙门氏菌中,59.78%的菌株对萘啶酮酸产生抗性,对环丙沙星、左氧氟沙星和加替沙星耐药的菌株比例分别为22.91%,17.88%和16.20%。214株萘啶酮酸抗性菌中,qnr A,qnr B,qnr S和aac(6′)-Ib-cr基因的检出率分别为11.68%,18.22%,3.27%和24.77%。82株环丙沙星抗性菌中,从gyr A和par C基因中共检出135个氨基酸突变点,其中从gyr A基因中检出65个突变点,从par C基因中检出70个突变点。gyr A基因中以Asp87Asn突变最为常见(47.69%;31/82),其次分别为Asp87Gly(38.46%,25/82),Asp87Tyr(4.62%,3/82),Ser83Phe和Asp87Asn双突变(3.80%,1/82),Asp87Asn和Ile89Val双突变(3.80%,1/82),Asp87Asn和Val90Gly双突变(3.80%,1/82)。par C基因中Ser80Arg突变最为常见(90.00%,63/82),其次分别为Met118Ile-Arg119Leu-Thr121Ser三突变(4.29%,1/82),Ser80Arg和Tyr120Phe双突变(2.86%,1/82),Ser80Ile(1.43%,1/82)和Ala81Val(1.43%;1/82)。结论:4省市中鸡肉源沙门氏菌对萘啶酮酸和部分氟喹诺酮类抗生素耐药严重,其中解旋酶和拓扑异构酶基因突变以及沙门氏菌携带的qnr A,qnr B,qnr S和aac(6′)-Ib-cr基因是沙门氏菌耐药的重要原因。     

宁波市河水环境中沙门菌分布特征和耐药性

目的了解宁波市人工河水环境中沙门菌的血清型分布特征及耐药情况,为预防、控制相应食源性疾病发生提供科学根据。方法对河水样品进行离心浓缩、蛋白胨水增菌液增菌、亚硒酸盐胱氨酸增菌液选择性增菌和沙门菌显色平板分离沙门菌,对分离菌株采用系统生化和血清凝集进行鉴定,并采用纸片法检测菌株对8种抗生素的耐药性,对多重耐药菌株和耐β-内酰胺类抗生素菌株扩增主要相关耐药基因。结果 2014年1月至2015年12月,共采集48份河水样品,分离沙门菌株105株,主要血清型为鼠伤寒(26株)、德尔卑(14株)、里森(8株)、肠炎(4株)、阿贡纳(4株)、斯坦利(4株)、阿格玛(4株),其他及未分型沙门菌41株。70株(66.7%)耐至少一种抗生素,对抗生素的耐药率分别为氨苄西林53.3%、四环素42.9%、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑32.4%、庆大霉素11.4%、环丙沙星4.8%、头孢噻肟4.8%和产超广谱β-内酰胺酶4.8%。β-内酰胺类抗生素相关耐药基因为TEM型(n=52)、OXA型(n=6)和CTX-M型(n=3),58.1%的菌株1类整合子基因阳性。结论人工河水环境中沙门菌检出率较高,且部分血清型为重要的食源性致病菌,检出菌也有较高的耐药性,携带多种耐药基因,提示食源性疾病防控中需关注环境细菌的危害。     

全基因组测序和real-time PCR法检测食源性沙门氏菌parC、gyrA基因突变特征

以45 株食源性沙门氏菌喹诺酮耐药株为对象,采取全基因组测序和实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,real-time PCR）法检测parC、gyrA基因突变位点,并对检测方法可靠性、耐药基因突变特征进行评估和分析。首先将4 株沙门氏菌进行二代全基因组测序,根据测序数据分析结果,建立了一种real-time PCR法检测gyrA Asp87Tyr、gyrA Asp87Asn、parC Thr57Ser和parC Ser80Ile这4 个突变位点。将沙门氏菌进行qnrS、qnrA、qnrB的real-time PCR检测,发现有31 株菌未检出qnr基因。以这31 株菌为对象,采取real-time PCR法筛查基因突变位点,结果发现parC Thr57Ser和gyrA Asp87Asn型突变最常见。将real-time PCR阳性的10 株菌扩增parC、gyrA基因全长并测序,real-time PCR检测和测序结果完全吻合,说明了real-time PCR检测的可靠性。全基因组测序和real-time PCR法相结合的方法用于耐药基因突变筛查,既可以发现新的基因突变,又可以快速筛查大样本的主要突变类型,可作为沙门氏菌耐药性研究的一种可靠手段。     

2019—2020年汉中市食源性食品中ST198型肯塔基沙门菌的耐药性研究

目的 ST198型肯塔基沙门耐药性极强,本研究通过对食源性食品中ST198型肯塔基沙门菌的分子流行病学及耐药特性研究,旨在为防控此菌在食源性及其与人类之间的传播提供科学依据。方法 对2019年7月至2020年5月从陕西省汉中市7家不同超市采集的冷冻整鸡和猪肉馅进行肯塔基沙门菌分离鉴定、血清型分型、药物敏感试验及全基因组测序。结果 158份冷冻整鸡和163份猪肉馅中共分离鉴定出127株沙门菌,其中从6家超市共分离到14株ST198型肯塔基沙门菌。药物敏感试验试验显示,14株ST198型肯塔基沙门菌均为多重耐药菌,所有菌株均同时对5类及以上抗菌药物耐药;对左氧氟沙星、多西环素、卡那霉素、链霉素、四环素、萘啶酸、环丙沙星耐药率均达到100%;对头孢唑啉、氨苄西林、头孢噻肟、庆大霉素、氨曲南、头孢吡肟耐药率也达到92.86%;这些菌株仅仅对亚胺培南、美罗培南、多粘菌素完全敏感。其中产ESBLs阳性菌株检出率为92.86%。耐药基因检测显示,14株ST198型肯塔基沙门菌均同时发生染色体上喹诺酮耐药决定区(QRDR)gyrA和parC双突变,突变类型有Asp87Asn(85.71%),Asp87Gly(14.29%),Ser83Phe(100%),Thr57Ser(100%),Ser80Ile(100%)。ESBLs基因以blaCTX-M-55和blaTEM-141为主,78.57%的菌株同时携带这2种基因,14.29%的菌株携带blaCTX-M-14b。78.57%的菌株携带大环内酯类耐药基因mph(A)。系统发育树结果显示,ST198型肯塔基沙门菌在汉中市6家不同的超市间存在相同克隆分子菌株。结论 陕西省汉中市ST198型肯塔基沙门菌主要从冷冻整鸡中分离,对喹诺酮类和三代头孢菌素以及替代药物阿奇霉素耐药严重,ESBLs阳性率和喹诺酮耐药决定区发生突变率高。此菌在汉中市不同超市间有一定传播关系,可能存在交叉污染和上一级污染来源的传播。     

沙门氏菌环丙沙星诱导株marR, soxR和acrR基因突变与多重耐药性的相关性研究

本文对11株动物源体外诱导的环丙沙星抗性沙门氏菌的mar操纵子基因marO, marR, marA, marB, soxR, soxS和acrR基因(包括启动子区)的点突变进行检测,结果显示在沙门氏菌诱导株中marR, soxR和acrR基因检测到新突变,而marO, marA, marB和soxS基因未发现突变.应用实时荧光定量PCR对诱导株的marA和soxS基因及外排泵基因acrA, acrB和tolC的mRNA表达水平进行检测,结果表明这些基因的表达量均显著增加,且marA, soxS和acrAB-tolC的mRNA表达水平与沙门氏菌诱导株的多重耐药表型(Mar表型)相关,环丙沙星诱导株对其它氟喹诺酮类药物和结构不相关的抗生素均产生耐药.本研究结果表明沙门氏菌诱导株的调控基因突变和mar操纵子介导的acrAB-tolC的表达上调均贡献了沙门氏菌诱导株的氟喹诺酮抗性和Mar表型,且诱导株的marR, soxR和acrR基因突变与氟喹诺酮抗性和Mar表型具有相关性.     

肉鸡养殖场中环丙沙星和头孢噻肟双重耐药沙门菌耐药机制的研究

目的阐明养殖场肉鸡及其环境中环丙沙星和头孢噻肟耐药沙门菌的分布和耐药机制特点。方法对河南省4个不同地区肉鸡养殖场及环境中分离的沙门菌进行环丙沙星和头孢噻肟双重耐药菌株的筛选和鉴定,并对分离株进行药敏试验、喹诺酮类和超广谱β内酰胺酶耐药机制研究。结果从52株养殖场肉鸡肛拭子及环境中筛选出5株耐环丙沙星和头孢噻肟的沙门菌,均为印第安纳沙门菌,有AMP-CAZ-CHL-CIP-CTX-GEN(n=1)和AMP-CAZ-CHL-CIP-CTX-GEN-SXT-TET(n=4)两种耐药谱。喹诺酮耐药机制研究显示,5株菌的拓扑异构酶编码基因gyr A和par C均有点突变出现,均携带了质粒介导的喹诺酮耐药基因,包括oqx AB、aac(6')-Ib-cr基因,而qnr A、qnr B、qnr S、qnr C、qnr D和qep A基因则未检出。超广谱β-内酰胺酶耐药机制显示,5株菌均为blaCTX-M-65型。结论耐环丙沙星和头孢噻肟的菌株存在于肉鸡养殖环节及其环境中,并具有复杂的喹诺酮耐药机制和可传播的超广谱β内酰胺酶耐药机制。为阐明农场-餐桌-感染者传递链条中耐药关联性,为社区感染防控、临床抗生素用药提供科学依据,我国应该加强肉鸡等养殖业沙门菌多重耐药菌株的监测。     

弯曲菌对氟喹诺酮类抗生素耐药性及耐药机制研究进展

弯曲菌(Campylobacter)是一类全球普遍关注的人兽共患病病原菌, 也是引发人类急性胃肠炎的主要食源性致病菌之一。氟喹诺酮类药物是临床治疗弯曲菌感染性疾病的经验用药, 但在动物疫病和人类医疗中过度使用抗生素导致了耐药弯曲菌的增加, 近年来世界各地陆续出现弯曲菌对氟喹诺酮类抗生素耐药的研究报道。本文就氟喹诺酮类抗生素的杀菌机制、弯曲菌对氟喹诺酮类抗生素的耐药现状和耐药机制进行综述, 为氟喹诺酮类抗生素对弯曲菌的合理应用提供一定的参考。     

Characterization of the quinolone resistance mechanism in foodborne Salmonella isolates with high nalidixic acid resistance

Sixteen Salmonella strains resistant to nalidixic acid isolated from kimbab, the most popular ready-to-eat (RTE) food in Korea, and chicken meat were selected for this study. The resistant strains were shown to have high minimal inhibitory concentrations (MICs) against nalidixic acid (512 ~ 4096 μg/mL). Among them, 4 Salmonella enterica serovar Haardt isolates showed multi-drug resistance (MDR) patterns with reduced susceptibility to fluoroquinolone (0.5 μg/mL of ciprofloxacin MICs). The mechanisms of quinolone resistance in the nalidixic acid resistant strains were characterized by PCR and sequence analysis. The presence of plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) genes and amino acid changes in the quinolone resistance determining region (QRDR) were investigated by PCR-based detection and sequencing, and the efflux pump inhibition test was also done using phe-arg-β-naphthylamide (PAβN). Although PMQR genes were not detected in any of the tested strains, the QRDR mutations were found in this study: single mutation in gyrA (Asp87Tyr, Asp87Gly, and Asp87Asn), double mutations in gyrA (Ser83Thr) and parC (Thr57Ser), and single mutation in parC (Thr57Ser). MICs of nalidixic acid were reduced by 2- to 32-folds by the efflux pump inhibitor, PAβN. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) was carried out to confirm the epidemiological relationship between the nalidixic acid resistant strains. The PFGE patterns were classified into 6 groups at cutoff level of 70 ~ 100% correlation on the dendrogram. Some strains of serotype Haardt and Enteritidis showed several values of genomic identity in accordance with strains, sources, and isolation year. We suggest that point mutation on QRDR and efflux pump systems involved in antimicrobials had independent effects on drug-resistance regardless of bacterial genomic variation.     

Salmonella hadar对喹诺酮类药物耐药性及其耐药基因分析

目的：研究新疆乌鲁木齐市部分农贸市场内检出的21 株Salmonella hadar对2 种喹诺酮类抗生素的药敏性及相关耐药基因,更好地了解耐药性的产生和传播途径,确保食品安全。方法：用琼脂稀释法测定Salmonella hadar的药敏性,用聚合酶链式反应和测定基因序列的方法确定耐药沙门氏菌中与喹诺酮类抗生素耐药性相关的喹诺酮类抗性决定区突变基因以及质粒携带的耐药基因。结果：21 株Salmonella hadar对萘啶酮酸的耐药率达100%,对环丙沙星表现为敏感;qnrB、qnrA、qnrS基因的检出率分别为52.30%、4.76%、4.76%;21 株Salmonella hadar均为gyrA和parC基因同时突变,gyrA基因的突变类型是Ser83Phe,parC基因的突变类型是Thr57Ser。结论：新疆乌鲁木齐Salmonella hadar对喹诺酮类药物的耐药状况应当予以关注,其耐药决定区突变基因及质粒携带的耐药基因在一定程度上会影响Salmonella hadar的耐药机制。     

肠炎沙门氏菌和哈瓦那沙门氏菌的耐药性及耐药基因分析

为了保障食品安全,更好的了解耐药性的产生及传播的途径,研究了新疆乌鲁木齐市部分农贸市场内检出的17株肠炎沙门氏菌和11株哈瓦那沙门氏菌的药敏性及相关耐药基因。用琼脂稀释法测定沙门氏菌的药敏性,用聚合酶链式反应和测定基因序列的方法确定耐药沙门氏菌中与喹诺酮类药物相关的抗性决定区突变基因以及质粒携带的耐药基因。17株肠炎沙门氏菌对环丙沙星和头孢西丁表现为100%敏感,对萘定酮酸的耐药率为94.1%,头孢曲松的耐药率为17.6%,qnr B检出率为64.7%,17株肠炎沙门氏菌发生Gyr A基因突变,主要突变类型为Asp87Tyr;11株哈瓦那沙门氏菌对甲氧芐啶、氯霉素、磺胺二甲异唑、磺胺甲基异恶唑/甲氧苄啶、萘啶酮酸、头孢西丁的耐药率为100%、63.6%、36.4%、18.2%、9.1%和9.1%,氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸敏感率为100%,qnr B,qnr S的检出率均为9.1%,11株哈瓦那沙门氏菌Par C基因突变类型为Thr57ser。新疆乌鲁木齐肠炎沙门氏菌和哈瓦那沙门氏菌耐药情况比较严重,对抗生素的耐药状况应当予以关注,其喹诺酮类药物耐药决定区突变基因及质粒携带的耐药基因在一定程度上会影响肠炎沙门氏菌和哈瓦那沙门氏菌的耐药机制。     

乌鲁木齐牛羊肉源沙门氏菌对喹诺酮类药物的耐药状况及相关基因分析

目的:研究牛羊肉源沙门氏菌对15种抗生素的药敏性以及对喹诺酮类药物的相关耐药基因,更好地了解沙门氏菌耐药性的产生和传播途径,为预防与控制沙门氏菌疾病提供基础信息。方法:用琼脂稀释法测定沙门氏菌的药敏性,用聚合酶链式反应和基因序列测定法确定耐药沙门氏菌中与喹诺酮类抗生素耐药相关的喹诺酮类抗性决定区基因突变及质粒携带的耐药基因。结果:30株沙门氏菌中对甲氧苄啶、氯霉素、萘啶酮酸、四环素、磺胺异甲二唑、链霉素、甲氧嘧啶/磺胺异恶唑、阿莫西林、氨苄西林的耐药率分别为100%、86.7%、66.7%、60.0%、50.0%、33.3%、26.7%、6.7%、6.7%,对环丙沙星、头孢曲松、庆大霉素、卡那霉素、头孢西丁、阿米卡星均表现为敏感;qnr B、qnr A、qnr S、aac(6′)-Ib-cr基因的检出率分别为5.0%、45.0%、0%、5.0%;30株沙门氏菌发生gyr A基因突变的菌株数为14株,主要突变类型是Ser83Phe,发生par C基因突变的菌株数为25株,主要突变类型是Thr57Ser。结论:乌鲁木齐牛羊肉源沙门氏菌的耐药情况较为严重,对喹诺酮类药物的耐药状况应当予以关注,其耐药突变基因及质粒携带的耐药基因在一定程度上是导致沙门氏菌耐药的重要原因。     

沙门氏菌中与萘啶酮酸和环丙沙星抗性相关基因及突变的检测分析

目的：研究与萘啶酮酸和环丙沙星抗性相关基因在分离于陕西、新疆和广东等9 省（市）食源性沙门氏菌中的分布及其与菌株耐药表型间的相关性。方法：使用玻片凝集法鉴定沙门氏菌的血清型,琼脂稀释法测定沙门氏菌的药敏性,聚合酶链式反应法测定9 种耐药基因。结果：814 株沙门氏菌共涵盖83 种血清型,其中鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium,24.08%）、肠炎沙门氏菌（S. enteritidis,19.41%）、印第安纳沙门氏菌（S. indiana,13.27%）和德比沙门氏菌（S. derby,5.16%）等血清型比较常见。553 株（67.94%）和219 株（26.90%）沙门氏菌分别对萘啶酮酸和环丙沙星耐药。814 株沙门氏菌中,oqxB阳性菌株的平均检出率（31.82%）显著高于qnrA（24.94%）、oqxA（24.57%）、qnrB（24.45%）、qnrS（10.32%）和qepA（3.07%）阳性菌株检出率（P＜0.05）,与aac(6’)-Ib阳性菌株的检出率（27.52%）间无显著性差异。7 种耐药基因在5 种最常见血清型、不同采样地来源、不同地域来源以及不同样品来源菌株中的检出率间存在一定差异。gyrA中共检出221 个氨基酸突变点,以Ser83Phe/Asp87Gly双突变（21.27%）最为常见,其次分别为Ser83Phe（16.29%）、Asp87Gly（13.57%）、Ser83Tyr（12.22%）、Asp87Tyr（11.31%）、Asp87Asn（10.41%）、Ser83Phe/Asp87Asn双突变（9.95%）、Ser83Tyr/Asp87Gly双突变（2.71%）、Asp87Val（0.90%）、Gly75Phe（0.45%）、Asp87Asn/Ile89Val双突变（0.45%）和Asp87Asn/Val90Gly双突变（0.45%）;parC中共检出217 个突变点,以Ser80Arg（64.49%）突变最为常见,其次分别为Thr57Ser（35.05%）和Ser80Arg/Gly72Phe双突变（0.47%）。结论：陕西等9 省（市）食源性沙门氏菌血清型种类繁多,对萘啶酮酸和环丙沙星耐药较为普遍,oqxA、oqxB、qepA、qnrA、qnrB、qnrS和aac(6’)-Ib基因比较流行,在gyrA和parC中检出多种变异,这些基因的存在和抗生素靶位变异可能是导致沙门氏菌耐药的重要原因。