GM-CSF(12-127)突变体生物学活性的研究

GM－CSF的结构与功能研究表明，N-端的1～13位氨基酸并非生物学活性所必需，且干扰与受体的结合。作者采用PCR突变的方法删除1～11位的氨基酸，保留12位的脯氨酸。突变后的基因经全序列测定证实，之后插入原核高效表达载体pBV220中表达，基因突变后的表达量及表达产物的稳定性均有所提高。大批量表达后经提取包涵体、疏水层析、离子交换层析，最终获得了纯的GM－CSF（12－127）突变体蛋白，其生物学活性比未突变蛋白有明显提高，达3×107U／mg蛋白。受体竞争结合实验显示突变体蛋白受体亲和活性增强。     

重组人IL- 18的高效表达、纯化及诱导KG—1细胞产生高水平IFN-γ

目的 研究IL－18在大肠杆菌中高效表达及纯化工艺，并诱导KG－1 细胞产生IFN－γ。 方法利用RT－nPCR从正常人胎肝组织中扩增获得人IL－18基因，克隆于pThiohisA载体，转化宿主菌BL－21，1mmol/LIPTG；诱导，表达产物以包涵体形式存在，经2％Triton X－100洗涤，在 8mol/L尿素下变性阴离子柱层析，透析复性后再经凝胶过滤纯化，通过纯化产物诱导入骨髓瘤单核细胞 KG－l（ATCC CCL－246）产生 IFN－γ，并检测其生物学活性。结果 获得了在大肠杆菌中的稳定高效表达，表达的目的蛋白占菌体总蛋白的25％左右，纯化后纯度可达95％以上，具有显著的刺激细胞产生IFN－γ的活性。结论 制备具有生物学活性高纯度的rhIL－18方法的建立，为基础研究与临床应用开发奠定了基础。     

白细胞介素-6的基础、临床研究及开发动向

白细胞介素－6（IL－6）作为多机能细胞因子，对免疫，造血系统、消化、内分泌系统，神经系统等具有广泛的作用。目前国外开发重组人IL－6已进人11期临床试验，我国也将重组IL－6的开发列为重点项目，已进人临床前研究阶段。本文将IL－6基础与临床开发研究近况作以概述。一、IL．6分子生物学基础（一）产生及化学性质IL一七，开始作为诱导B细胞抗体产生的分子而纯化分离，经26KD蛋白的CDNA克隆和氨基酸序列分析，证明其与IFN－pZ，杂交瘤／浆细胞瘤生长因子等是同一种物质，称为IL－6。产生IL－6的细胞包括：T细胞、B细胞、单核…     

重组人白细胞介素-6包含体溶解工艺研究

本文系统研究了影响大肠杆菌表达的重组人白细胞介素 6 (rhIL 6 )包含体溶解的因素 ,确定了rhIL 6包含体溶解的最佳工艺条件 ,即在 pH为 8 4的 5 0mmol/LTris HCL缓冲体系中 ,变性剂尿素和还原剂 β 基乙醇 (β ME)的浓度分别为 8mol/L和 5 0mol/L ,包含体含量为 1 0mg/mL ,在 4℃下溶解 1h。包含体溶解后蛋白含量可达到 1 3mg/mL左右 ,目标蛋白的溶解率达到 98% ,纯度为 5 0 %左右     

链霉亲和素-蛋白A融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

将合链霉亲和亲-蛋白A（Streptavidin－proteinA）融合蛋白基因的表达质粒pTSAPA导入大肠杆菌BL21（DE3），成功地表达了该融合蛋白，经SIJS－PAGE及免疫印迹等方法证实该蛋白既具有IgG的结合活性，又具生物素结合活性。     

基因工程人白介素-6中试工艺研究

本研究对基因工程人白介素－6成熟肽在大肠杆菌中的表达、纯化及检定做了一系列的研究,建立了一套罐培养诱导表达,乙酸裂解包涵体,复性及纯化的中试工艺,并制备3批半成品,经检定各项指标已接近国家基因工程产品质控标准。     

血栓调节蛋白核心片段的基因克隆、表达及鉴定

目的 获得血栓调节蛋白及其核心片段,以便研制临床诊断治疗制品。方法 应用ＰＣＲ获得血栓 调节蛋白ＥＧＦ４～６的基因片段,构建克隆载体ＥＧＦ４－６／ＰＹ和表达载体ＥＧＦ４－６／ＰＢＶ２２０）,表达血栓调节蛋白ＥＧＦ４-６。结果 原核细胞表达量约占菌体可溶性蛋白的１２％,经ＫＰＴＴ试剂盘检测具有生物学活性。结论 为进一步 研究临床诊断治疗制剂创造了条件。     

3,6-二氯水杨酸O-烷基化工艺的研究

通过正交实验探讨了以3，6－二氯水杨酸为原料，经O－烷在化反应合成3，6－二氯－2－甲氧基苯甲酸的工艺。各因素对O－烷基化反应收率的影响顺序为：反应温度＞反应压力＞NaOH配比＞保温保压时间。O－烷基化反应的最佳工艺条件为3，6－二氯水杨酸：氢氧化钠（物质的量比＝1：4．5，反应温度100℃，反应压力0.6MPa，保温时间6h。在此条件下，O－烷基化收率为92．6％。     

3,6-二氯水杨酸O-甲基化工艺的研究

探讨了以3，6－二氯水杨酸为原料，经O－甲基化反应合成3，6－二氯－2－甲氧基甲酸的工艺。通过正交实验得到O－甲基化反应的最佳工艺条件为：n(3,6－二氯水杨酸）：n（氢氧化钠）＝1：4．5，反应温度100℃，反应压力0．6MPa，保温时间6h，在此条件下，O－甲基化收率为92．6％。     

重组结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白的原核表达、纯化及其生物活性

目的原核表达、纯化重组结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,并检测其生物活性。方法将Ag85a-ESAT6融合基因片段插入pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物在变性条件下经Ni-琼脂糖凝胶层析柱纯化复性后,在体外对经5种不同类型的表达结核杆菌Ag85a和ESAT6的重组痘苗病毒免疫的小鼠脾淋巴细胞进行刺激,以MTT法检测脾淋巴细胞的增殖反应。结果重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约41000,主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的55.65%;纯化复性的重组融合蛋白纯度达95%以上,表达量约为1.2g/L发酵液,且具有良好的反应原性;与空痘苗病毒或生理盐水免疫的小鼠相比,5种重组痘苗病毒免疫的小鼠脾淋巴细胞与Ag85a-ESAT6融合蛋白共培养后,增殖活性明显升高(P<0.01)。结论成功利用原核系统表达了结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,纯化复性的Ag85a-ESAT6融合蛋白具有生物学活性。     

人白细胞介素-24基因的克隆、表达和纯化

目的对人白细胞介素-24(hIL-24)进行克隆、表达和纯化。方法分离人外周血单个核细胞,ConA刺激培养,提取细胞总RNA,应用RT-PCR技术从外周血单个核细胞中扩增hIL-24成熟肽编码区,定向克隆至融合表达载体pGEX-4T-1,重组载体pGEX-4T-1/hIL-24经DNA测序鉴定后,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,阴离子交换层析纯化融合蛋白,SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果所得hIL-24基因经序列分析,与GenBank公布一致。所构建融合表达载体pGEX-4T-1/hIL-24测序正确,转化BL21(DE3)后,37℃诱导表达相对分子质量约为44000的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的30.63%。经纯化后,纯度达85%以上。Westernblot检测能与兔抗人IL-24的多克隆抗血清发生结合反应。结论已成功构建了hIL-24的融合表达载体pGEX-4T-1/hIL-24,并在大肠杆菌中高效表达,纯化后获得了高纯度的融合蛋白,为hIL-24的功能及活性研究奠定基础。     

重组人白细胞介素-12(CHO细胞)的纯化及其活性

目的建立CHO细胞表达的重组人白细胞介素-12(rhIL-12)的纯化工艺,并检测纯化的rhIL-12的生物活性。方法取高效表达rhIL-12的CHO工程细胞培养上清液,采用层析结合硫酸铵沉淀的方法进行分离纯化,ELISA法测定目的蛋白的含量,并计算回收率;SDS-PAGE、SEC-HPLC和Westernblot对纯化样品进行鉴定;以PBMCIFNγ诱生法检测纯化rhIL-12的生物活性。结果纯化的rhIL-12的总回收率为56.4%;经SEC-HPLC检测,其纯度达99.2%;SDS-PAGE分析显示,两个亚基的相对分子质量分别与理论值(40000和35000)相符;Westernblot分析显示,rhIL-12可与相应抗体发生特异性结合;rhIL-12诱生IFNγ量与rhIL-12浓度呈典型的S型曲线关系,具有剂量依赖性,其效价为8.3×106IU/mg。结论已建立了CHO细胞表达的rhIL-12纯化工艺,该工艺成本低,操作简便,纯化产物回收率和纯度高,适于工业化生产。     

重组人IL-31蛋白纯化方法的比较研究

目的比较两种方法纯化rhIL-31的效果。方法将含pET32a/rhIL-31的重组菌E.coli.BL21(DE3)经IPTG诱导表达,通过超声波破碎,包涵体的提取溶解,分别经G75凝胶层析和镍琼脂糖凝胶FF层析进行蛋白纯化,通过SDS-PAGE对纯化结果进行比较分析。结果镍琼脂糖凝胶FF层析法的杂蛋白去除率高于凝胶层析法,所得蛋白纯度略高。结论比较重组人IL-31蛋白的纯化效果,镍琼脂糖凝胶FF层析的效果比G75凝胶层析的效果好。     

人白细胞介素-29的生物信息学分析

目的利用生物信息学技术对人白细胞介素-29(Human nterleukin-29,IL-29)进行分析,为定点突变hIL-29,以提高其生物学活性奠定理论基础。方法利用生物信息学技术分析克隆得到的hIL-29基因,预测hIL-29基因编码蛋白的理化性质、结构、功能及可能影响其生物学活性的关键氨基酸位点;预测其三维结构,并与IFNλ3的晶体结构进行比对;对检索到的9个物种的IL-29基因同源序列进行比对,并构建系统进化树。结果 hIL-29基因编码蛋白含200个氨基酸残基,其N-末端19个氨基酸为信号肽,成熟肽的相对分子质量为20 018,理论等电点为9.08,肽链中含一个由胞内向胞外的跨膜结构域;hIL-29的空间构象由6个α螺旋(A～F)和无规则卷曲组成,螺旋A、B和F可能是hIL-29与特异性受体结合而发挥生物学效应的活性部位,A、F螺旋中有4个氨基酸残基可能是影响其生物学活性的关键氨基酸位点;系统进化分析显示,hIL-29与狗、猫、大熊猫、马、野猪、黑猩猩、长臂猿的IL-29具有较高的同源性,处于同一个大分枝,而人、黑猩猩、长臂猿的IL-29处于同一个小分枝,在系统进化树中的距离最近。结论关键位点氨基酸的差异可能对hIL-29的生物学活性影响较大,可作为对hIL-29进行分子改造的突变位点。本研究为后续进行hIL-29的定向改构及其构效关系等的深入研究奠定了理论基础。     

呼吸道合胞病毒F2蛋白与结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6蛋白的融合表达及纯化

目的在大肠杆菌中融合表达呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F2蛋白与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)早期分泌抗原靶6(Early secretory antigenic target-6,ESAT-6)蛋白,并进行纯化。方法分别从MTB标准菌株H37Rv及含F蛋白全长基因的pMD18-T-f质粒中扩增esat-6-f2基因,插入原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-30a-esat-6-f2,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,经镍离子亲和层析柱纯化。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;重组融合蛋白ESAT-6-F2相对分子质量约为21 000,主要以包涵体形式表达,可与小鼠抗His单克隆抗体特异性结合;纯化的融合蛋白纯度可达90%以上。结论成功在大肠杆菌中表达并纯化了重组融合蛋白ESAT-6-F2,为进一步研究其免疫原性和免疫保护性奠定了基础。     

轮状病毒Vp6蛋白的免疫荧光检测

目的检测在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的重组轮状病毒(Rotavirus,RV)Vp6蛋白和RV SA11感染的MA104细胞中不同时间表达的Vp6蛋白及其分布规律。方法应用纯化的重组A组人轮状病毒TB-Chen株Vp6(rVp6)蛋白和RVSA11分别免疫豚鼠,制备抗血清,以抗rVp6豚鼠血清作为检测抗体,应用间接免疫荧光技术检测rVp6蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达。分别用抗Vp6和抗RV SA11豚鼠血清检测Vp6蛋白和RV SA11株在感染的MA104细胞中的分布。结果在轮状病毒感染的MA104细胞和大肠杆菌BL21(DE3)中均能检测到轮状病毒Vp6蛋白。以抗RV SA11血清作为一抗检测感染细胞,比用抗rVp6血清检测具有更强的敏感性。结论免疫荧光试验可用于轮状病毒Vp6蛋白的检测。     

抗RBC/HBsAg ds-diabody包含体复性条件的优化

目的优化以包含体形式表达的抗RBC/HBsAg ds-diabody的复性条件。方法在大肠杆菌BL21/λDE3中诱导表达抗RBC/HBsAg ds-diabody,收获包含体,变性后,分别经透析复性和稀释复性方法复性,并以两种特异性结合活性检测复性效果,对pH值、复性时间和温度进行优化。结果包含体经变性后,pTH-dsR30KD特异蛋白占总蛋白的85%,pTdsR-H30KD特异蛋白占总蛋白的96%;ds-diabody抗体以稀释复性效果较好;在碱性(pH8.8～10)、低温(4℃)条件下复性72h效果最好。结论优化了抗RBC/HBsAg ds-diabody包含体的复性条件。     

高压匀浆破碎释放重组大肠杆菌提取包含体过程的研究

用高压匀浆机对重组大肠杆菌细胞进行破碎以释放重组人白细胞介素－6(rhIL-6)包含体,系统研究了高压匀浆过程中物理和化学因素的影响,包括匀浆次数,操作压力,料液的pH及悬浮体系的影响。从而选择操作压力为800MPa。悬浮体系为去离子水,经3次破碎,表达量为20％的 菌体可获得粗包含体的纯度约40%。此外,本文还对该高压匀浆破碎过程进行了动力学分析。