直接竞争酶联免疫分析方法检测猪肉中的沙丁胺醇

建立了一种用于检测沙丁胺醇的直接竞争酶联免疫分析(ELISA)方法,方法灵敏度(IC50)为0.80μg/L,检测限(IC15)为0.06μg/L,检测的线性范围0.06～20.00μg/L。与克伦特罗的交叉反应率为100%,与特布他林的交叉反应率为10.5%,与其他结构类似物并无明显的交叉反应,因此可以采用本实验建立的直接竞争酶联免疫方法同时测定食品中的沙丁胺醇和克伦特罗。本实验的样品处理方法简便,猪肉样品中的检测限为0.6μg/kg,添加三个浓度的样品,其添加回收率均在85%～100%之间,RSD值小于5.51%。     

直接竞争酶联免疫吸附法检测食品中三聚氰胺残留

采用酶标抗原建立了高效、高灵敏的三聚氰胺直接竞争的ELISA（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测方法。方法 以三聚氰胺单克隆抗体包被作为固相抗体,辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase,HRP）标记的抗原与标准品（或样品）中三聚氰胺竞争结合抗体,建立了直接竞争酶联免疫检测体系。结果 以三聚氰胺为标准品建立标准曲线,得到方法的IC50为8.84μg/L,灵敏度为0.65μg/L,线性范围0.9-35μg/L;检测样品的回收率为70.0%-127.9%,与三聚氰酸交叉反应率为60%,其他结构类似物基本无交叉反应。结论 本方法灵敏度高、特异性强、检测快速, 可以满足实际样品的检测需求。     

酶联免疫分析方法测定动物性食品中西马特罗残留

目的 建立检测西马特罗药物残留的酶联免疫分析方法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。方法 对主要影响因素, 包括包被原稀释倍数、抗体稀释倍数、竞争时间、标准品稀释液pH等参数进行优化, 对样品进行前处理, 经提取净化后进行检测, 并对ELISA检测结果与仪器方法进行对比。结果 西马特罗ELISA方法的最佳反应条件为: 抗原稀释倍数为100000, 抗体稀释倍数为150000, 标品稀释液pH为7.5, 竞争反应时间为20 min。在最佳反应条件下, 绘制标准曲线, 西马特罗的IC50为1.32 μg/L, 线性范围为0.16~6.95 μg/L, 检出限为0.09 μg/L。西马特罗在0.16、0.32、1.6 μg/kg添加水平的回收率分别为80.31%~113.81%, 变异系数低于10%, 且实际样品的测定结果与超高效液相串联质谱法的相关性良好(r2=0.9962)。结论 本研究建立的ELISA方法具有较高的灵敏性, 适合西马特罗残留检测。     

酶联免疫吸附法快速检测黄曲霉毒素

结合间接竞争反应机制,运用酶联免疫吸附技术(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),从抗原(antigen,Ag)包被时间、体系反应温度、酶标二抗作用时间、显色时间等主要因素开展快速检测黄曲霉毒素改进方法的研究。研究结果表明适宜的优化条件为:采用Ag包被20 h、反应温度24℃左右、酶标二抗作用时间30 min、底物显色时间15min。通过对饲料等11种样本的检测得出:半抑制浓度IC50<0.1μg/L,添加回收率在67%~116%,灵敏度达到0.03μg/L,线性系数>0.99,板内变异小于5%。检测试验结果良好,表明该改进方法具有可行性。     

食品中苏丹红Ⅰ间接竞争ELISA方法的研究

目的 建立食品中苏丹红Ⅰ免疫学检测方法.方法 本室自制获得单克隆抗体,优化反应条件,初步建立检测苏丹红Ⅰ的间接竞争ELISA方法,确定抗原包被浓度为1.00 μg/ml,包被温度为4℃过夜37℃1 h,单抗稀释倍数为1:3200,底物作用时间15 min.结果 检测方法的回归方程和相关系数为:y=-38.541x+131.1,r=0.9841;线性范围为0.053～0.92 μg/L,最低检测浓度为0.018μg/L,平均回收率为84.72%.结论 该方法能够检测样品中苏丹红Ⅰ,具有检测限低、耗时短、成本低的特点,有一定的应用前景.     

沙丁胺醇直接酶联免疫快速检测的方法

沙丁胺醇与瘦肉精同属于禁用的饲料添加剂,可以在动物体内大量残留,人体过量摄入会引起中毒反应。为了建立沙丁胺醇的快速检测方法,从硫酸沙丁胺醇出发制备了半抗原沙丁胺醇丁二酸衍生物,用混合酸酐法将半抗原与载体蛋白-钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)偶联作为免疫抗原制备了沙丁胺醇的多克隆抗体,建立了沙丁胺醇直接竞争酶联免疫检测方法,该方法抗体最佳包被抗体量为1μg/孔,酶标抗原稀释比例为1∶16000,掩蔽剂采用脱脂奶粉。所建立的方法具有很高的灵敏度和特异性I,C50为0.90ng/mLI,C15达到了0.05ng/mL,远低于国家残留限量标准,与沙丁胺醇的结构类似物基本没有交叉反应。     

酶标抗原直接竞争ELISA方法检测呋喃唑酮代谢物残留

采用酶标抗原建立了高效、高灵敏的呋喃唑酮代谢物直接竞争的ELISA检测方法。以呋喃唑酮单克隆抗体包被作为固相抗体,HRP标记的抗原与标准品(或样品)中呋喃唑酮的代谢物衍生物竞争结合抗体,建立了直接竞争酶联免疫检测体系。以3-氨基-2-恶唑烷酮的衍生物(CPAOZ)为标准品建立标准曲线,得到方法的IC50为0.08μg/L,灵敏度为0.015μg/L,线性范围0.025~0.5μg/L;检测样品的平均回收率为82.0%~121.0%,与其他结构类似物基本无交叉反应。建立呋喃唑酮酶标抗原直接竞争酶联免疫检测方法,灵敏度高、特异性强、操作简单,可以满足畜禽水产实际样品的检测需要。     

特布他林残留酶联免疫检测方法的建立

采用自主制备的特布他林特异性抗体建立特布他林残留的间接竞争酶联免疫(ELISA)检测方法,对该检测体系的灵敏度、准确度、精密度、特异性进行测定,并将该检测方法与高效液相色谱(HPLC)法进行对比分析。结果表明:特布他林残留检测体系的检测范围为1～100ng/mL,灵敏度为0.47ng/mL,检测限为1ng/mL,回收率80%～99%,与盐酸克伦特罗、硫酸沙丁胺醇的交叉反应率分别为94.9%、93.9%,与盐酸莱克多巴胺及肾上腺素的交叉反应率小于0.01%。采用HPLC法进行沙丁胺醇残留的检测时,其检测范围为10～200μg/mL,检测限为1μg/mL,回收率为79.2%～94.8%。ELISA法与HPLC法相比,灵敏度较高、特异性强、检测结果准确度相近,但在检测结果稳定性方面逊于HPLC法。     

基于HRP标记抗体的黄曲霉毒素M1的直接竞争-ELISA快速检测方法

为构建快速检测乳制品中黄曲霉毒素M1(AFM1)的直接竞争-酶联免疫吸附(dc-ELISA)体系,将辣根过氧化物酶(HRP)与高纯度抗AFM1单克隆抗体进行偶联后对其与AFM1竞争性反应条件进行优化,并利用AFM1污染标准物质ERMI-BD282(0)、ERMI-BD 283(0.11μg/kg)、ERMI-BD 284(0.44μg/kg)等对检测体系的灵敏度和精确性进行验证。结果当AFM1-BSA包被质量浓度0.25μg/L、抗AFM1 mAb-HRP稀释2000倍时dc-ELISA检测AFM1的IC50为0.75μg/L,检测范围为0.015～4.05μg/L,添加AFM1至0.45μg/L的鲜奶样品中检测回收率平均为80%,dc-ELISA可满足鲜乳中AFM1国家残留限量标准0.5μg/kg的检测要求。该体系可应用于鲜奶制品中AFM1大于0.5μg/kg污染样品的快速初筛。     

竞争抑制酶联免疫吸附法快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素P

目的 建立一种稳定性强、灵敏度高的快速检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素P(staphylococcal enterotoxin P,SEP)的单克隆抗体竞争抑制酶联免疫吸附法(Enzyme-linked Immunosorbent assay,ELISA)。方法 根据ELISA的检测程序,利用交叉方阵滴定法确定SEP抗原的最佳包被浓度及单克隆抗体的最佳倍比稀释浓度,再对辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(HRP-IgG)最佳稀释浓度及最佳反应时间进行筛选,然后通过测定450nm处不同SEP抗原包被条件(包被液类型、包被环境)、封闭液类型及浓度、封闭时间、竞争反应温度、反应方式(预混反应、直接反应)下的OD值对检测条件进行优化,最后用灵敏度、批内变异、批间变异和加标样品回收率对方法进行评价。结果 SEP抗原最佳包被浓度为2.5 μg/mL,鼠单抗血清稀释度1:6000,酶标抗稀释度1:3000;反应1 h,最佳包被条件为磷酸盐缓冲液4 ℃过夜,10%脱脂乳封闭2 h,37 ℃直接竞争反应。此方法的线性回归方程为：y = 0.4166x - 0.7415(R2 = 0.9908),灵敏度为0.954 μg/mL,批内及批间变异系数均低于3 %,对人工污染的脱脂牛奶、LB液体培养基中肠毒素蛋白SEP的回收率高于98%。结论 本实验建立了一种能够快速检测葡萄球菌肠毒素SEP的ELISA方法。     

Eu3+ 标抗原盐酸克伦特罗的时间分辨荧光免疫检测

采用时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)建立简便、快速、灵敏的盐酸克伦特罗(clenbuterol hydrochloride,CBL)检测方法。以自制盐酸克伦特罗单克隆抗体包被96 孔微孔板作为固相抗体,Eu3+ 标记抗原与样品中的CBL 竞争结合抗体,建立直接竞争荧光免疫分析体系。猪尿、组织样品添加回收率实验表明：方法灵敏度为0.02μg/L,样品回收率为91%～101%,与沙丁胺醇、莱克多巴胺等结构类似物的交叉反应率均小于1%。建立盐酸克伦特罗铕标抗原直接竞争时间分辨免疫检测方法,方法灵敏度高、特异性强,且操作简单,完全可以满足现有实际检测需求。     

酶联免疫吸附法测定水产品中甲基睾酮残留

建立了测定水产品中甲基睾酮(MT)残留的间接竞争酶联免疫吸附法(ic ELISA)。采用琥珀酸酐法衍生化制备半抗原MT17,进一步偶联钥孔血蓝蛋白(KLH)制备免疫原MT17-KLH,经动物免疫成功获取特异性识别MT的多克隆抗体(与其它结构类似物交叉反应小于1%)。优化确立了ic ELISA最佳检测条件:包被原浓度100μg/L,MT多克隆抗体稀释度1/1.2×105,抗体反应时间40 min,药物稀释液为PBS,水产样品经乙腈提取,N-丙基乙二胺吸附剂(PSA)分散固相萃取(DSPE)净化后用于ic ELISA测定。本方法的抑制中浓度IC50为3.48μg/L,检测线性范围为0.77~13.06μg/L。水产样品加标回收率为81.02~103.19%,相对标准偏差为4.46%~13.14%,测定结果与液相色谱-质谱联用法具有良好的相关性(R=0.9971)。本方法可用于水产品中甲基睾酮残留的快速测定。     

环丙沙星时间分辨荧光免疫分析方法的建立与应用

建立基于时间分辨荧光免疫分析技术的环丙沙星(CPF)间接竞争检测方法。将环丙沙星-卵清白蛋白(CPF-OVA)包被于固相微孔板,CPF标准品或样品中CPF与CPF包被原(CPF-OVA)共同竞争限量的CPF抗体,用铕标羊抗兔IgG示踪,建立环丙沙星时间分辨荧光免疫分析方法(CPF-TRFIA);考察包被质量浓度、抗体稀释液、反应时间等对方法灵敏度的影响。结果表明：在优化条件下,该方法的检测限为0.5μg/L,半抑制质量浓度(IC50)为4.32μg/L,线性范围(IC20～IC80)为1.14～28.85μg/L;该方法对蜂蜜中CPF平均回收率为80.66%～100.30%,对牛奶中CPF的平均回收率为76.30%～95.22%,两者的平均批内和批间变异系数分别为7.42%和10.92%。CPF-TRFIA间接竞争法测定环丙沙星具有灵敏度高、特异性好、性能稳定的优点,适于高通量筛查。     

特布他林残留的酶联免疫检测方法的建立

采用自主制备的特布他林特异性抗体建立特布他林残留的间接竞争酶联免疫(ELISA)检测方法,对该检测体系的灵敏度、准确度、精密度、特异性进行测定,并将该检测方法与高效液相色谱(HPLC)法进行对比分析。结果表明：特布他林残留检测体系的检测范围为1～100ng/mL,灵敏度为0.47ng/mL,检测限为1ng/mL,回收率80%～99%,与盐酸克伦特罗、硫酸沙丁胺醇的交叉反应率分别为94.9%、93.9%,与盐酸莱克多巴胺及肾上腺素的交叉反应率小于0.01%。采用HPLC 法进行沙丁胺醇残留的检测时,其检测范围为10～200μg/mL,检测限为1μg/mL,回收率为79.2%～94.8%。ELISA 法与HPLC 法相比,灵敏度较高、特异性强、检测结果准确度相近,但在检测结果稳定性方面逊于HPLC 法。     

时间分辨荧光免疫法检测食品中黄曲霉毒素B1的含量

目的建立高灵敏度的时间分辨免疫法检测黄曲霉毒素B_1的含量。方法通过双功能螯合剂异氰酸苄基二乙烯三胺四乙酸络合稀土元素Eu~(3+)标记抗AFB_1的单克隆抗体,以AFB_1-OVA为固相抗原,优化反应条件,建立直接竞争时间分辨免疫检测方法。结果优化条件后,方法灵敏度为0.02μg/L,IC_(50)为0.73μg/L,线性检测范围为0.01~30μg/L,大米、花生、黄豆和干果样品回收率在91%~104%之间,检测结果准确;与结构类似物AFB_2、AFG_1、AFG_2、AFM_1的交叉反应率分别为17.3%、4.49%、2.37%和0.73%。结论本方法灵敏度高、特异性强、检测快速,可以满足实际样品的检测需求。     

沙丁胺醇直接竞争ELISA 法快速测定

建立沙丁胺醇的直接竞争ELISA(dcELISA)快速检测方法,采用高碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记沙丁胺醇单克隆抗体,棋盘滴定法确定包被抗原质量浓度和抗体稀释倍数,通过单因素试验,考察反应体系中表面活性剂、离子浓度、甲醇体积分数、pH 值因素对dcELISA 性能的影响,确定最优检测条件,同时考察方法的特异性。结果表明：酶标抗体克分子比为2.1 时偶合物的滴度最高,最佳反应条件为包被抗原质量浓度1μg/mL,酶标抗体稀释2560 倍,0.01mol/L、pH7.4 的磷酸盐抗体稀释液(PBS)中含体积分数0.05% 的Tween-20、0.5mol/L NaCl溶液和体积分数5% 的甲醇时dcELISA 具有最高的灵敏度和最好的稳定性,所建立方法的IC50 为10.3ng/mL,检测限为0.049ng/mL,线性范围0.3～76.30ng/mL,批内变异系数13.8%,批间变异系数为22.38%,与克伦特罗交叉反应率为321.18%,与溴布特罗交差反应率为29.09%,与其他结构类似物没有明显交叉反应。本研究所建立的dcELISA 可用于沙丁胺醇和克伦特罗的多残留检测。     

应用酶联免疫法检测鱼肉、蜂蜜中氯霉素的残留量

检测鱼、蜂蜜中氯霉素残留,以评价试剂盒性能为目的。用间接竞争酶联免疫分析法(ELISA法)对鱼肉、蜂蜜中的氯霉素残留量进行了测定。结果表明,标准曲线的R2为0.9943,线性方程y=-0.3668x+0.4353,IC50为0.71μg/L,线性范围为0.05～4.05 ng/mL。鱼肉和蜂蜜中的检测限分别为0.126μg/kg和0.081μg/kg。鱼肉和蜂蜜的添加回收率分别大于88.1%和85.5%,批内变异系数分别小于15.8%、13.6%,批间变异系数小于15.5%、12.3%。与氯霉素琥珀酸钠的交叉反应率为152.63%,与其他药物的交叉反应率均小于0.01%。该法测定氯霉素灵敏准确,重复性好,特异性高,适合用于检测鱼肉、蜂蜜中的氯霉素残留。     

测定三种乳蛋白抗原性间接竞争ELISA法的建立

为检测牛乳中主要致敏蛋白的抗原性,以商业兔抗αs-酪蛋白、兔抗β-乳球蛋白、兔抗牛血清白蛋白(BSA)多克隆抗体为一抗,标记HRP的羊抗兔Ig G为二抗,TMB为底物,对牛乳中主要致敏蛋白:αs-酪蛋白、β-乳球蛋白、BSA建立间接竞争ELISA(ic ELISA)。结果表明,αs-酪蛋白、β-乳球蛋白及BSA抗原包被质量浓度分别为5,2和2μg/m L。一抗最佳稀释倍数分别为1∶800,1∶400和1∶300。建立的三种蛋白的ic ELISA的线性检测范围分别为15.625~1 000 ng/m L、31.25~1 000 ng/m L和62.5~2 000 ng/m L。三种乳蛋白包被条件均为4℃,12 h,酶标二抗的最佳稀释倍数为1∶1 200,以1%的明胶作为封闭液。三种乳蛋白ic ELISA的3个浓度添加试验的批内及批间最大变异率分别为5.16%,7.46%,6.6%和6.78%,6.81%,6.06%,三种蛋白建立的ic ELISA回收率在94.34%~109.92%。表明所建立的方法重复性好,灵敏度高,可用于牛乳中此三种蛋白致敏性的测定。     

水产品中氯霉素酶联免疫吸附分析法的构建与应用

以氯霉素(CAP)为研究对象，通过系统优化反应条件，构建CAP的间接竞争酶联免疫分析法，并应用于水产品中CAP残留量的检测。氯霉素间接竞争酶联免疫分析方法的最佳工作条件为：0.05μg/孔包被量(CAP-OVA),4℃包被14 h,0.5%脱脂乳粉封闭液，CAP抗体稀释倍数为1∶16 000。结果表明：构建的间接竞争酶联免疫分析方法的灵敏度(IC₅₀)为4.88μg/mL，检测限(IC15)为0.29μg/mL，方法特异性良好，对氯霉素结构类似物和同类抗生素的交叉率低于0.1%。对大黄鱼、缢蛏、牛蛙进行5.0,10.0μg/kg和20.0μg/kg加标回收试验，回收率在83.90%～100.73%范围。本方法的日内和日间变异系数范围为2.28%～6.96%，该检测结果与LC-MS/MS分析结果具有良好的一致。本研究构建的CAP酶联免疫吸附分析法操作简单，灵敏度高，可应用于多种水产品中氯霉素残留量的快速定量检测，同时也为其它小分子危害物的酶联免疫分析方法的构建提供技术借鉴。     

基于上转换纳米材料与磁分离的荧光免疫分析方法检测食品中酪胺

实验基于间接竞争反应原理,结合上转换纳米材料与磁分离技术,建立分析食品中酪胺荧光免疫的方法,并进一步应用于肉制品、水产品及发酵制品中酪胺的检测。最佳实验条件为12 μg抗体偶联NaYF4Yb,Tm上转换纳米材料制备信号探针,70 μg包被原偶联磁性聚苯乙烯微球制备捕获探针,信号探针添加量为70 μL,感应探针添加量为100 μL,孵育时间为30 min。方法线性范围为0.1～100.0 μg/L,检测限为0.05 μg/L,该方法可特异性识别酪胺,与其他生物胺及其结构类似物无交叉反应。样品添加回收率为86.44%～101.62%,变异系数小于10%,该方法适用于食品中酪胺的快速检测。