产肠毒素性大肠埃希菌K99-987P-F41原核表达载体的构建、表达及其纯化

目的构建产肠毒素性大肠埃希菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K99-987P-F41原核表达载体,诱导表达后进行纯化。方法利用PCR技术,从ETEC基因组DNA中扩增出K99、987P、F41部分基因片段,将3段目的基因融合亚克隆至大肠埃希菌原核表达载体p ET30a(+),构建重组质粒p ET30a(+)-K99-987P-F41,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经镍离子亲和层析纯化。结果重组表达质粒p ET30a(+)-K99-987P-F41经PCR、酶切及测序鉴定证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约60 000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的63.8%,纯度为81.2%,浓度为8.953 mg/ml,可同时被天然和重组抗原多抗识别,具有良好的反应原性。结论 ETEC重组质粒p ET30a(+)-K99-987P-F41可在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,利用镍离子亲和层析柱纯化可获得融合蛋白。     

人膜联蛋白A3的原核表达及纯化

目的 原核表达人膜联蛋白(annexin,ANX)A3(ANX A3),并进行纯化。方法 提取人胎盘样品总RNA,反转录建立c DNA文库,用KOD-Plus高保真DNA聚合酶扩增anx A3基因编码区全长,连接至克隆载体p EASY-Blunt上,测序鉴定。用primix extaq酶重新扩增anx A3基因,与表达载体p EASY-E1连接,构建重组表达质粒p EASY-anx A3,转化E.coli Transetta DE3,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经6×His纯化介质及Bio-Rad Bio Logic Duo Flow Chromatography Systems纯化后,经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果 重组表达质粒经菌落PCR鉴定,阳性克隆可扩增出972 bp的目的片段,与NCBI中Gen Bank上报道的anx A3序列完全一致。纯化的重组蛋白相对分子质量约为36 000,可与鼠Anti 6×His-Tag单克隆抗体特异性结合,浓度为400μg/ml。结论 成功构建了重组原核表达质粒p EASY-anx A3,并在E.coli Transetta DE3中表达了重组蛋白,为进一步研究ANX A3在哮喘病的起因和形成中的作用及机制奠定了基础。     

梅毒螺旋体-15脂蛋白的原核表达及其纯化

目的原核表达梅毒螺旋体-15(Treponema pallidum-15,TP-15)脂蛋白基因,并进行纯化及鉴定。方法人工合成455 bp的TP-15基因序列,克隆至原核表达载体p ETDuet-1,构建原核表达质粒p ETDuet-1/TP-15,经双酶切及测序鉴定后,将鉴定正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达;表达产物经Ni2+亲和层析纯化,纯化产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组质粒p ETDuet-1/TP-15经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达产物相对分子质量约27 000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的2.34%,纯化后蛋白纯度达99%以上,可与HRP标记的梅毒螺旋体多克隆抗体发生特异性结合。结论构建了原核表达质粒p ETDuet-1/TP-15,并于E.coli中成功表达,纯化后获得了高纯度的TP-15蛋白,为进一步研究建立梅毒病人血清检测试剂盒奠定了基础。     

4Aβ_(1-15)的原核表达及纯化

目的在大肠杆菌中表达4Aβ1-15,并进行纯化。方法以重组质粒pcDNA3.1-s4Aβ1-15为模板,PCR扩增1-2Aβ1-15基因,并克隆至pQE30a原核表达载体中,构建重组表达质粒pQE30a-2Aβ1-15,再以其为模板,扩增2-2Aβ1-15基因,克隆入pQE30a-2Aβ1-15质粒中,构建重组原核表达质粒pQE30a-4Aβ1-15,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白。结果重组表达质粒pQE30a-4Aβ1-15经双酶切和测序证明构建正确;表达的目的蛋白相对分子质量约为18 000,主要以可溶形式表达,表达量约占上清液总蛋白的40%,可与鼠抗人Aβ40单抗特异性结合;纯化后基本除去了杂蛋白。结论成功构建了重组原核表达质粒pQE30a-4Aβ1-15,表达并纯化了His6-4Aβ1-15融合蛋白,为阿尔茨海默病基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达及活性鉴定

目的克隆大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(ltB)基因,构建其原核表达质粒,并对表达产物进行活性鉴定。方法采用PCR技术从产毒大肠杆菌129株基因组DNA中扩增ltB基因,克隆入载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET-32a(+)-ltB,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂层析柱进行纯化,纯化产物采用ELISA法鉴定其与牛GM1的结合活性。结果重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确,所克隆的ItB基因与GenBank中报道的相应核苷酸序列的同源性为99.9%。重组菌诱导4h,目的蛋白表达量最高,约占菌体总蛋白的25%。纯化的重组LTB蛋白纯度约为96%,具有与牛GM1特异性结合的生物学活性。结论已成功克隆了ltB基因,并构建了其原核表达质粒,表达的重组蛋白具有一定的生物学活性。     

胱硫醚β-裂解酶的表达纯化及性质研究

通过PCR从大肠杆菌(E.coli K12)基因组DNA中扩增出胱硫醚β-裂解酶(Cystathionineβ-1yase,CBL)基因,构建了能高效表达CBL的重组菌E.coli BL21(pETDuet- 1-CBL).重组菌在30℃、0.5 mmol·L-1 IPTG存在条件下诱导9h,可溶性CBL的表达重达18...     

金黄葡萄球菌肠毒素C3基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达金黄葡萄球菌肠毒素C3(SEC3)基因。方法以金黄葡萄球菌基因组DNA为模板,扩增SEC3基因中编码成熟蛋白的基因片段,克隆至pET-32a(+)表达载体,构建重组表达质粒SEC3-pET-32a,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果经PCR扩增获得720bp的SEC3基因;重组表达质粒构建正确;表达产物的相对分子质量约为43000,为可溶性表达;纯化的重组蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆并原核表达了SEC3基因,为单克隆抗体和诊断试剂的制备及SEC3抗毒素的研制提供了材料。     

牛产气荚膜梭菌α-ε毒素基因的融合表达及其纯化

目的融合表达产气荚膜梭菌α毒素基因和ε毒素基因的融合基因α-ε,并进行纯化。方法利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌C57-8株基因组DNA中扩增出α毒素基因的部分基因片段,插入到质粒p ET28a-ε上,构建含α-ε融合毒素基因的表达质粒p ET28a-α-ε,转化至E.coli BL21(DE3)plys S感受态细胞中,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组质粒p ET28a-α-ε经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,与预期的基因序列重合率为99%。表达的重组蛋白相对分子质量约78 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的22.7%,纯度为91.2%,可与小鼠产气荚膜梭菌多抗血清特异性结合,具有良好的反应原性。结论成功构建了重组质粒p ET28a-α-ε,并在E.coli BL21(DE3)plys S中表达了重组α-ε融合蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,可作为预防牛肠毒血症基因工程亚单位疫苗的候选抗原。     

基孔肯雅病毒E2蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)E2主要结构蛋白,为预防CHIKV感染及亚单位疫苗的研究奠定基础。方法根据Gen Bank上公布的CHIKV基因序列合成E2基因,并进行密码子优化,以提高原核表达效率。设计引物并以合成的E2基因为模板,PCR扩增CHIKV E2,连接到原核表达载体p ET-28a上,构建重组原核表达质粒p ET-28a-CHIKV E2,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后进行纯化。结果重组原核表达质粒p ET-28a-CHIKV E2经双酶切鉴定构建正确,测序结果与原序列一致。表达的CHIKV E2融合蛋白相对分子质量约为47 000,可与His标签抗体特异性结合,纯化后纯度达95%以上。结论成功在大肠埃希菌中表达了CHIKV E2蛋白,纯化后蛋白纯度较高,为CHIKV亚单位疫苗的免疫试验奠定了基础。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白2a转肽酶区的原核表达及其纯化

目的原核表达耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)青霉素结合蛋白2a(penicillin binding protein 2a,PBP2a)转肽酶区,并进行纯化及鉴定。方法 PCR扩增编码PBP2a转肽酶区的mec Af基因片段,克隆至原核表达载体p GEX-6p-1中,构建重组表达质粒p GEX-6p-mec Af,经双酶切(Bam HⅠ和Eco RⅠ)及测序鉴定正确后,转化感受态大肠埃希菌(E.coli)BL21进行诱导表达;经蛋白亲和层析柱纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果重组表达质粒p GEX-6p-mec Af经双酶切(Bam HⅠ和Eco RⅠ)及测序鉴定证明构建正确;表达产物的相对分子质量约63 000,表达量约占菌体总蛋白的14.5%,纯化后纯度达90%。结论成功构建了PBP2a转肽酶区的原核表达质粒,目的蛋白在E.coli中获得高效表达,为制备单克隆抗体及建立MRSA快速检测方法奠定了基础。     

新德里金属-β-内酰胺酶的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的原核表达新德里金属-β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1),并制备其多克隆抗体。方法以临床分离的产NDM-1的臭鼻克雷伯杆菌为模板,PCR扩增NDM-1基因,克隆入pET-28a载体,构建重组原核表达质粒pET-28a-NDM-1,转化E.coli BL21(DE3)pLyss,IPTG诱导表达重组蛋白。表达的重组蛋白经硫酸铵沉淀、离子交换层析、Ni亲和层析及分子筛层析纯化后,免疫日本大耳白兔,制备NDM-1多克隆抗体。抗体经硫酸铵沉淀和SPA-Sepharose亲和层析纯化后,Western blot鉴定其特异性。结果重组表达质粒pET-28a-NDM-1经PCR及测序鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为28 000,诱导表达的重组菌破菌上清存在较强的β-内酰胺酶活性,表明NDM-1蛋白为可溶性形式表达;最终纯化获得的NDM-1蛋白纯度高于95%;制备的NDM-1多克隆抗体能与诱导表达的重组菌胞外蛋白特异性结合。结论成功原核表达了NDM-1,并制备了其多克隆抗体,为NDM-1的快速检测提供了新的思路。     

重组人抗缪勒管激素C-末端蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达重组人抗缪勒管激素(human anti-Müllerian hormone,hAMH)C-末端蛋白,并进行纯化。方法 PCR法扩增hAMH C-末端蛋白基因,插入至载体pET-28a,构建重组表达质粒pET-28a-hAMH C。重组质粒转化感受态E. coli BL21(DE3),终浓度为1. 0 mmol/L的IPTG诱导表达h AMH C-末端蛋白。扩大培养后进行Ni亲和层析柱纯化,12%SDS-PAGE分析纯化产物。结果经菌落PCR及测序鉴定,重组质粒pET-28a-hAMH C构建正确。表达及纯化产物均可见相对分子质量约12 500的目的蛋白条带,纯度达90%以上。结论原核表达了重组hAMH C-末端蛋白,纯化后获得了较高纯度的目的蛋白。     

稻瘟菌角质酶MGG＿09100的生物信息学分析及其原核表达

目的对稻瘟菌角质酶MGG_09100进行生物信息学分析及原核表达。方法应用在线程序分析稻瘟菌角质酶MGG_09100蛋白的保守结构域、信号肽剪切位点及跨膜结构域。PCR法扩增稻瘟菌角质酶MGG_09100基因,克隆至原核表达载体pETM-10,构建原核表达质粒pETM10-MGG_09100。重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达、变性、复性后,进行Ni-NTA亲和层析及分子筛层析分离纯化。结果稻瘟菌角质酶属α/β水解酶超家族,在第18和19个氨基酸之间存在信号肽剪切位点,前20个氨基酸中可能出现跨膜结构。经菌落PCR及测序验证,重组表达质粒pETM10-MGG_09100构建正确。IPTG诱导表达产物大部分以包涵体形式存在,经变性、复性、纯化后,可溶性重组蛋白的相对分子质量约24 000,浓度可达6 mg/mL。结论成功构建了原核表达质粒pETM10-MGG_09100,获得了可溶性稻瘟菌角质酶MGG_09100蛋白。本研究为该蛋白的功能及水稻稻瘟病致病机理的深入研究奠定了基础。     

屋尘螨变应原Derp 5在大肠埃希菌中的表达及纯化

目的克隆表达屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus,Derp)第5组变应原Derp 5基因,在E.coli中表达、纯化重组Derp 5蛋白,并分析其血清Ig E反应原性。方法以合成的Derp 5核酸序列为模板进行PCR扩增,产物经双酶切后与载体pCold-TFM连接,构建重组表达质粒pCold-TFM-Derp 5,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。用镍离子亲和层析柱和凝胶过滤层析柱纯化目的蛋白,尘螨过敏患者血清鉴定其IgE反应原性。结果重组表达质粒pCold-TFM-Derp 5经双酶切、PCR及测序鉴定证明构建正确;在E.coli BL21(DE3)中实现了目的蛋白的可溶性高表达,毎升细菌表达产物经纯化可得到纯度95%以上的Derp 5蛋白约6 mg。纯化的重组Derp 5蛋白与尘螨过敏患者血清IgE有结合活性。结论成功构建了Derp 5原核表达载体,高效表达并纯化了目的蛋白,纯化的重组Derp 5蛋白具有良好的IgE反应原性,为屋尘螨变态反应性疾病的特异性诊断和治疗以及致敏蛋白的进一步研究奠定了基础。     

十二指肠贾第虫α-6贾第素的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化十二指肠贾第虫α-6贾第素(α-6 Giardin)。方法以十二指肠贾第虫的c DNA为模板,PCR扩增α-6 Giardin基因片段,连接至p MD18-T载体,得到重组克隆质粒p MD18-T-α-6,将双酶切后得到的目的片段连接至p ET-28a表达载体中,得到重组表达质粒p ET-28a-α-6,转化至E.coli Rosetta感受态细胞中,IPTG诱导表达目的蛋白α-6 Giardin,收集菌体,离心后进行SDS-PAGE及Western blot鉴定,并利用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合的α-6 Giardin蛋白。结果质粒p ET-28a-α-6经双酶切鉴定,证明构建正确;表达的目的蛋白α-6 Giardin为带His标签的包涵体蛋白,相对分子质量约40 000,可与鼠抗His单抗特异性结合,具有良好的反应原性;纯化的重组α-6Giardin融合蛋白相对分子质量约40 000,纯度可达80%。结论成功克隆、表达并纯化了十二指肠贾第虫α-6Giardin蛋白,为十二指肠贾第虫α-6 Giardin进一步的功能研究奠定了基础。     

单增李斯特菌溶血素O的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化单增李斯特菌溶血素O(Listeriolysin O,LLO)。方法 PCR扩增LLO hly基因,并插入pET-32a载体,构建重组表达质粒pET-hly,转化入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,切胶纯化重组蛋白,并进行Westernblot分析。结果克隆的hly基因长1 515 bp,与GenBank中登录的hly基因的核苷酸序列同源性为99%;重组表达质粒pET-hly经酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为55 000,表达量占细菌总蛋白的45.2%;纯化的重组蛋白可与单增李斯特菌阳性血清反应。结论已成功原核表达并纯化了LLO,为下一步诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

多聚磷酸盐激酶的原核表达、纯化及酶活性测定

目的原核表达、纯化多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinase,PPK),并检测其酶活性。方法采用PCR法从尿路致病性E. coli CFT073中扩增ppk基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-ppk,转化感受态E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。重组蛋白经His-镍亲和层析柱分离纯化后,采用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色法测定纯化蛋白的酶活性。结果重组表达质粒pET-28a-ppk经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。重组蛋白的相对分子质量约80 000,纯化后蛋白浓度为518. 9μg/mL。在加入10μg PPK酶,37℃孵育30 min的条件下测得的PPK酶活性最大,为(645. 16±32. 98)U/mg。结论成功在E. coli中表达了重组PPK,纯化产物纯度较高,具有PPK酶活性,为后续以PPK为靶点新型抗菌药物的研发奠定了基础。     

伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的原核表达及其纯化

目的原核表达并纯化伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(Trichinella pseudospiralis serine protease inhibitor,Tpserpin)基因,并鉴定其抗原性。方法从伪旋毛虫肌幼虫提取总RNA,RT-PCR扩增Tp-serpin基因,插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-Tp-serpin,转化大肠埃希菌(E.coli)Rosetta gami(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析后,用Ni-NTA Agarose亲和层析纯化,纯化产物经SDS-PAGE分析纯度,Western blot鉴定反应原性。结果重组表达质粒pET-28a-Tp-serpin经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确,与GenBank中登录的Tp-serpin基因相似性达99%。表达的重组Tp-serpin蛋白相对分子量约43 000,表达量约占菌体总蛋白的40%,主要以可溶性形式存在;纯化后的重组Tp-serpin蛋白纯度达95%以上,可被伪旋毛虫感染60 d的猪血清特异性识别,具有较好的反应原性。结论成功构建了重组表达质粒pET-28a-Tp-serpin,并在E.coli Rosetta gami(DE3)中表达了重组蛋白,为旋毛虫病的血清学诊断候选抗原的研制及开发提供了科学依据,也为阐明serpin在伪旋毛虫入侵时期调节宿主免疫反应的作用奠定了基础。     

人乳头瘤病毒58型截短型L1蛋白与结核分枝杆菌早期分泌型抗原靶蛋白-6的融合表达及其抗血清的制备

目的原核表达人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)58型截短型L1(Truncated L1,tL1)蛋白与结核分枝杆菌早期分泌型抗原靶蛋白-6(Early secreted antigenic target-6,ESAT-6)融合蛋白,并制备其抗血清。方法利用PCR技术分别从HPV基因组DNA和ESAT-6-18T质粒DNA中扩增tL1和ESAT-6基因,构建重组原核表达质粒ESAT-6-tL1-pET-21a,分别转化E.coli BL21(DE3)和Rosetta,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白ESAT-6-tL1经镍离子亲和层析柱纯化后免疫昆明小鼠,ELISA检测血清抗体效价。结果 PCR扩增出750 bp的tL1基因片段和320 bp的ESAT-6基因片段,测序结果与GenBank登录的序列一致;重组表达质粒ESAT-6-tL1-pET-21a经双酶切鉴定,构建正确;表达的ESAT-6-tL1融合蛋白相对分子质量约40 000,在E.coli Rosetta中的表达形式为包涵体,纯化后纯度为85%,免疫小鼠血清抗体效价为1:4 000。结论成功表达了ESAT-6-tL1融合蛋白,并制备了其抗血清,为进一步研制检测HPV58的抗体奠定了基础。     

猪B型多杀性巴氏杆菌铁摄取调节基因Fur的生物信息分析及其原核表达

目的对猪B型多杀性巴氏杆菌铁摄取调节基因Fur进行生物信息分析,并检测原核表达产物的抗原性。方法以猪B型多杀性巴氏杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增Fur基因,克隆至载体p GEX-6p-1中,构建重组质粒p GEX-6p-1-Fur。利用生物信息学方法结合网络数据库测序分析Fur基因同源性、蛋白质理化特性、蛋白质结构并进行同源建模。将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经透析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组质粒p GEX-6p-1-Fur经双酶切鉴定构建正确。Fur基因全长432 bp,编码144个氨基酸,与禽Pm70菌株的Fur基因同源性达99.8%,与嗜血杆菌属亲缘较近;Fur蛋白空间结构与铁吸收调节蛋白2w57.1.A相似性较高,Fur蛋白为酸性脂蛋白,Fur蛋白二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,107-117位氨基酸区域作为抗原表位可能性较大,且Fur无跨膜区与信号肽,是相对成熟稳定的蛋白。以2w57.1.A为模板构建了可靠的三维结构分子模型。重组蛋白GST-Fur相对分子质量约44 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的33%,纯化后纯度达92%,重组蛋白GST-Fur可与多杀性巴氏杆菌制备的血清发生特异性结合。结论于E.coli中成功表达了重组蛋白GST-Fur,构建了可靠的三维结构模型,为进一步研究Fur蛋白功能及毒力作用机制奠定了基础。