致泻性大肠杆菌基因芯片检测方法的建立

建立一种多重PCR技术结合基因芯片检测方法,实现多种致泻性大肠杆菌(EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC和大肠杆菌O157)的快速、准确检测。筛选肠致病性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌及大肠杆菌O157的特异基因作为目的基因。设计9对引物和23条探针,进行多重PCR扩增,制备寡核苷酸芯片。将多重PCR扩增产物与带有特异探针的芯片杂交。用扫描仪扫描,判定细菌种类及型别。该基因芯片可特异性的检测EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC和大肠杆菌O157,具有良好的特异性,致病菌检测灵敏度可达104cfu/mL。所建立的多种致泻性大肠杆菌基因芯片方法检测方法特异性好,灵敏度高,具有较好的实用性。     

应用基因芯片技术检测肉及肉制品中5种致病菌

建立一种运用多重聚合酶链式反应(PCR)结合基因芯片技术检测大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌5种食源性致病菌的快速、准确、灵敏的方法。分别选取编码大肠埃希氏菌的slt基因、沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、志贺氏菌ipaH基因和单核细胞增生李斯特菌inlA基因,并以细菌16S rDNA基因作为阳性对照,设计引物和探针,进行多重PCR扩增,产物与含特异性探针的芯片杂交。结果表明：该基因芯片可同时特异性地检测5种致病菌,多重PCR检测灵敏度为20pg,而DNA芯片检测灵敏度可达2pg;用所制备的基因芯片检测实际肉及肉制品样品,准确率高于传统培养法。所建立的基因芯片检测方法特异性好、灵敏度高,可为食源性致病菌的检测提供理想手段。     

转基因大豆DNA检测芯片的研究

为提高对转基因大豆的监督检测能力，研制了转基因大豆DNA检测芯片。根据转基因大豆(Roundup Ready)中所转入的外源基因，选择CaMV35S启动子、NOS终止子、NOSIEPSPE基因和内源Lectin基因设计特异性引物，采用多重PCR法对待测样品进行扩增，通过缺口平移法合成DIGdUTP标记杂交探针，并制备基因芯片。在对PCR反应和扩增产物与芯片杂交条件进行优化的同时，比较了芯片检测的特异性和重复性，并对检测的灵敏度进行测试。结果表明，该方法具有较好的特异性和重复性，检测灵敏度可达0．5％，由于采用了多重PCR技术，一次可同时检测多个基因，提高了检测的准确性和效率。     

可视芯片检测大豆、水稻和玉米中的转基因成分

本研究选取9种常见转基因食品外源基因,设计了引物对与探针,并制备可视芯片。通过PCR对样品核酸进行扩增,将扩增产物与固定于可视芯片的特异性探针进行杂交分析,验证了芯片的特异性和重复性,并对检测芯片灵敏度进行测试。该方法可以一次检测出5种的常见转基因植物,且实验结果表明该方法高效、准确、简便、高通量、实用性强,灵敏度可达0.1%,并摆脱了基因芯片在杂交结果分析阶段对荧光扫描仪的依赖,杂交结果明显直观。     

转基因玉米DNA检测芯片的研究

根据转基因玉米中所转入的外源基因,选择CaMV35S启动子、NOS终止子、PAT基因和目的基因IVS2/PAT、CDPK/CryIA(b)、Maize genome/CaMV35S、PAT/CaMV35S1、Cry9C/CaMV35S!以及内源IVR基因设计特异性引物,采用多重PCR法对待测样品进行扩增,通过缺口平移法合成DIG-dUTP标记杂交探针,并制备基因芯片.在对PCR反应和扩增产物与芯片杂交条件进行优化的同时,比较了芯片检测的特异性和重复性,并对检测的灵敏度进行测试.结果表明,该方法具有较好的特异性和重复性,检测灵敏度可达0.1%.     

转基因番茄DNA检测芯片的研究

自19世纪70年代世界上第一例转基因植物问世以来，它对人类健康及环境的安全性问题，受到了全世界广泛的关注：本研究根据转基因番茄（Zeneea）中所转入的外源基因，选择CaMV35S启动子、NOS终止子、PG／NOS基因和内源PG基因设计特异性引物，采用多重PCR法对待测样品进行扩增，通过缺口平移法合成DIG—dUTP标记杂交探针，并制备基因芯片。在对PCR反应和扩增产物与芯片杂交条件进行优化的同时，比较了芯片检测的特异性和重复性，并对检测的灵敏度进行测试。结果表明，该方法具有较好的特异性和重复性，检测灵敏度可达0．5％，由于采用了多重PCR技术一次可同时检测多个基因，提高了检测的；隹确性和效率。     

基于TaqMan探针双重荧光PCR检测食品中肠道沙门氏菌和肠炎沙门氏菌

建立基于TaqMan探针双重重实时荧光PCR检测肠道沙门氏菌(Salmonella enterica,SP)和肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis,SE)的方法。根据SP的aceA基因(Gen Bank:U43344.1)、肠炎沙门氏菌特异序列SEP(GenBank:AF370707.1),分别设计引物和探针,在ace A探针的5′端标记FAM和SEP探针的5′端标记VIC,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测方法。试验结果,58株29种不同血清型肠道沙门氏菌均扩增出ace A基因扩增曲线,SEP特异性地扩增出15株SE,而28种不同血清型沙门氏菌和17株变形杆菌等阴性对照株扩增结果均为阴性。ace A和SEP的双重荧光PCR扩增效率分别为100%和104%,R2分别为0.999和0.998,最低检测浓度分别达到280 cfu/m L和260 cfu/m L。建立的方法特异性好、灵敏度高,整个试验可在31 h完成,是快速检测SP和SE的有效方法,可用于食品中SP和SE的特异性检测。     

转基因大豆低密度基因芯片的检测方法研究

目的建立Roundup Ready转基因大豆（简称RRS）的基因芯片检测方法,探讨其在转基因大豆检测中的应用。方法根据大豆中所转入的外源基因,选择camv35s启动子、nos终止子和cp4epsps基因,以大豆内源基因lectin基因为内参照基因设计了引物和探针,并制备了核苷酸芯片;通过多重PCR对样品核酸进行扩增和荧光标记后,将PCR产物与芯片杂交,检测大豆样品中所含的外源基因,并评价方法的灵敏度。结果检测转基因含量不同的RRS标准参考物,结果显示：camv35s启动子、nos终止子、外源基因cp4epsps检测灵敏度均可达0．45％。结论本研究所建立的基因芯片检测方法有良好的灵敏度及可重复性,有助于实现转基因大豆的高通量、高灵敏的检测。     

多重PCR法检测产志贺毒素性大肠杆菌的 4个血清型

目的建立多重PCR法检测产志贺毒素性大肠杆菌(shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC)主要血清型O26、O145、O45和O121的分析方法。方法根据GenBank登录序列,设计扩增O抗原翻转酶(wzx)基因的引物,建立PCR方法,并以STECO26、O145、O45和O121基因组为模板,检验多重PCR的灵敏度和特异性。使用建立的PCR,检测牛胴体表面拭子,阳性扩增条带送测序,以验证PCR扩增的可靠性。同时将阳性扩增样品,涂布显色平板,分离靶标血清型细菌。结果本研究成功建立STEC O26、O145、O45和O121的多重PCR方法, PCR循环参数中退火温度为60℃,扩增片段分别为249、353、890和587 bp。多重PCR直接检测O26、O145、O45和O121时,最低检测限介于10~3～10~4 CFU/mL,而增菌后再检测,最低检测限均为1CFU/m L。多重PCR用于其他血清型STEC,和非大肠杆菌扩增时,均未扩增出目的条带,只有O26、O145、O45和O121能够扩增出相应条带。当使用多重PCR直接检测胴体擦拭子时,阳性率为5.45%(3/55),主要为O26、O145血清型;增菌后检测阳性率为7.27%(4/55),主要为O26、O145和O121血清型。阳性PCR扩增样品,成功分离到O26两株、O145和O121各一株。分离菌株具有典型大肠杆菌的生化特性,携带STEC代表性毒力因子志贺毒素和紧密素,且具有多重耐药性。结论以STECO26、O145、O45和O121的wzx基因为检测靶标,成功建立多重PCR方法,灵敏度和特异性良好,与细菌分离联合使用,可减少工作量,精准分离目的病原菌。     

应用多重PCR-液相悬浮芯片技术检测转基因水稻品系

开展转基因水稻的多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）液相芯片检测方法研究。针对科丰6号（KF6）、科丰8号（KF8）、华恢1号（BT63）、克螟稻（KMD1）、M12、T1C-19、T2A-1、LL62和LL601九种转基因水稻的侧翼序列,设计合成了在生物素标记的多重PCR扩增引物与固定在荧光编码微球上的探针,建立了2 个多重PCR-液相芯片检测体系,可同时检测出这9 种转基因水稻成分。结果表明,9 种转基因水稻的引物和探针都具有较高的特异性,各组引物/探针之间无交叉扩增和非特异杂交,且在多重PCR-液相芯片检测中9 种转基因水稻品系的相对检测灵敏度达到0.1%水平,符合欧盟和其他国家有关转基因产品标识的要求。本方法的检测效率和准确性均高于传统方法,可作为进出口转基因产品和国内转基因检测的有效方法。     

多重PCR-液相芯片技术检测13个品系转基因玉米

为建立多重PCR-液相芯片检测13个品系的转基因玉米的方法,针对BT11,BT176,Mon810,Mon863,T25,GA21,NK603,TC1507,Mon89034,Mir162,Mon88017,MIR604和BVLA430101这13种玉米品系的侧翼序列,设计合成了品系特异性引物/探针。在生物素标记的PCR扩增产物与固定在荧光编码微球上的品系特异探针杂交后,对微球进行流式检测。试验结果显示,13种转基因玉米的引物和探针具有较高的特异性,引物/探针相互之间无交叉扩增和非特异杂交,大部分转基因玉米品系的检测灵敏度达到0.1%水平,符合欧盟和其他国家有关转基因产品标识的要求。本方法的检测效率和准确性均高于传统方法,可作为进出口转基因产品和国内转基因检测的有效方法。     

多重聚合酶链式反应技术检测罗非鱼5种常见食源性致病菌

目的 建立一种可同时检测无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门菌(Salmonella) 5种罗非鱼常见食源性致病菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)方法。方法 根据5种致病菌特异性基因片段设计并合成引物, 优化多重PCR体系条件, 并对多重PCR体系的特异性、灵敏度以及人工模拟样品进行检测。结果 建立的多重PCR方法可同时扩增5种目的菌株的特异性条带, 且不与非靶标细菌发生交叉反应。敏感性实验结果显示, 该方法对无乳链球菌、嗜水气单胞菌、沙门菌、霍乱弧菌、大肠杆菌纯培养物基因组DNA的检出限均为0.4 ng/μL。人工模拟样品检测结果显示, 该方法可以快速且准确地检测上述5种食源性致病菌, 且检出限可达到2×101 CFU/g。结论 本研究建立了一种可同时检测无乳链球菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌、大肠杆菌和沙门菌5种罗非鱼常见食源性致病菌的多重PCR检测方法。该方法的建立为罗非鱼常见食源性致病菌的快速检测提供了重要的技术手段。     

超级细菌NDM-1基因高通量微球悬浮芯片检测方法的建立

本研究以建立微球体悬浮芯片检测方法为目的,选择三种超级细菌NDM-1基因(metallo-beta-lactamase 1 gene)为目的基因,设计并合成标记特异性探针,与荧光编码微球偶联后与细菌NDM-1基因的PCR产物杂交反应,用微球悬浮芯片检测仪检测荧光信号,建立可快速检测该种基因的微球体悬浮芯片检测方法。特异性和灵敏度检测结果表明:该方法对NDM-1基因检测具有特异性,最低检测限可达10fg/μL,灵敏度高于普通PCR技术,提示微球体悬浮芯片是一种针对NDM-1的快速、灵敏、便捷的新型核酸检测技术。     

肉制品中表皮葡萄球菌实时荧光PCR检测方法的研究

根据表皮葡萄球菌16S基因片段序列,用Primer express 3.0设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立表皮葡萄球菌实时荧光PCR检测方法。通过对梯度含量的表皮葡萄球菌标准菌液样品DNA和多种细菌的DNA进行实时荧光PCR检测,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。实验结果表明,只有表皮葡萄球菌产生扩增曲线,其他细菌无扩增,说明引物及TaqMan探针特异性较好,检测灵敏度为1×10~3CFU/mL。该方法具有很好的研究价值和应用前景。     

基于多重连接依赖探针扩增（MLPA）技术检测加工食品中过敏原成分

该研究基于多重连接探针扩增技术（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification,MLPA）同时检测开心果、巴西坚果、芹菜、麸质、夏威夷果、芝麻、榛子、大豆、花生、葵花籽、核桃、腰果、杏仁、芥末等14种植物源性的过敏原成分,针对ITS序列设计特异性杂交探针,样本核酸经95 ℃变性后,与探针进行特异性结合,经连接和PCR扩增反应得到不同大小的目标片段,通过毛细管电泳分析目标片段的有无来判断是否含有待测过敏原成分。利用混合探针体系检测单一模板只能扩增出单一扩增峰,表明探针具有高特异性,检测限结果表明,MLPA扩增最低可检出的DNA质量浓度为1 ng/μL。通过20份实际样本的检测,证明该研究基于MLPA建立的加工食品中过敏原成分的检测方法,具有特异性强,灵敏度高的特点,可以应用于食品安全监管工作。     

利用基因芯片技术检测李痘病毒主要株系的研究

针对我国检疫性植物病毒即李痘病毒主要6个株系设计了6个特异性探针,同时设计了扩增该6个株系的一对通用引物,并确定了靶基因的PCR扩增体系和芯片杂交体系。对6个探针核酸序列进行同源性比对,结果表明探针之间的同源性只有39-61%,而各探针与本株系的同源性达到95%以上,因此适合作为检测李痘病毒主要株系的探针。成功设计的李痘病毒各主要株系的通用引物能够一次性扩增6个株系中的任何一个株系,而不需要做多重PCR,标记的扩增片段即可同芯片进行杂交,不但可以检测出李痘病毒,而且还能够明确是该病毒的哪个株系,检测结果直观明了,易于判定。芯片特异性好,能够正确区分6个株系,而且与其他植物病毒没有交叉反应。芯片的灵敏度高,可达到5pg/μL DNA模板浓度。     

应用可视芯片技术检测食品中常见致病菌的方法研究

利用特异性引物进行PCR扩增,并利用固定于可视芯片的特异探针与扩增产物进行杂交反应加以鉴定。利用可视芯片技术可以准确的检出沙门氏菌属和金黄色葡萄球、小肠结核肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌3种食品中常见致病菌,检测灵敏度可达8.5×101cfu/mL。利用可视芯片准确灵敏使用便捷的优点,建立了食品中常见致病菌鉴定方法,为食源性致病菌检测提供了一项快速有效的方法。     

肉制品中蜡样芽胞杆菌实时荧光PCR检测方法的研究

根据蜡样芽胞杆菌肠毒素基因片段序列,用Primer express 3.0设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立蜡样芽胞杆菌实时荧光PCR检测方法。通过对梯度含量的蜡样芽胞杆菌标准菌液样品DNA和多种细菌的DNA进行实时荧光PCR检测,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。实验结果表明,只有蜡样芽胞杆菌产生扩增曲线,其他细菌无扩增,说明引物及TaqMan探针特异性较好,检测灵敏度为1×10~3CFU/m L。该方法具有很好的研究价值和应用前景。     

1种高特异性的酶连接探针杂交芯片及其在转基因检测中的应用

酶连接探针杂交芯片是1种基于连接酶催化的探针杂交芯片技术,其原理是采用硫代引物保护法,利用lambda DNA外切酶将多重PCR产物切割成单链。在氨基修饰的芯片上固定5′-端探针,并与制备的产物单链进行杂交,加入荧光修饰的第2个探针与之前的探针进行酶连接反应,从而实现高度特异性、高通量检测。特异性和灵敏度试验表明,酶连接探针杂交芯片能有效消除假阳性信号,转基因检测的灵敏度达到0.1%,可应用于进出口检验检疫、食品安全监测等领域。     

集中空调系统积尘中嗜肺军团菌的污染研究

对广东省和海南省9家酒店集中空调系统的不同位置的积尘进行采样,应用巢式PCR方法,探讨酒店集中空调系统积尘中嗜肺军团菌的监测方法和污染情况。试验结果表明:巢式PCR方法检测积尘嗜肺军团菌的特异性较好;空调系统多个环节积尘严重并存在军团菌污染,空调机组风柜翅片嗜肺军团菌阳性率最高为33.3%;冷却塔与新风口直线距离在0~5m范围内,风管积尘军团菌阳性率随距离增加呈上升趋势。