应用通用引物量化检测鲜肉及其制品中羊源性成分

分别以牛、羊、猪、鸡、鸭、马线粒体细胞色素b基因为研究对象,设计羊源性成分特异性引物和探针,同时结合实时荧光定量PCR技术,引入16SrDNA内参基因校正羊种属特异性基因测定方法,建立快速、高通量的鲜肉及鲜肉制品中羊源性成分确证方法,实现科学准确的食品掺假量化判定技术体系。通过特异性、通用性及模拟混合样品的检测,对所建立方法进行验证。结果表明:建立的羊源性成分含量测定方法具有良好的特异性和通用性,且通过标准曲线的构建,呈现良好的线性关系均达0.996以上;通过羊种属特异性基因与16SrDNA内参基因Quantity值及校正系数,可以计算出样品中所含羊源性成份的质量百分比含量,经模拟混合样品的检测,回收率平均值到达96.25%,说明量化研究结果具有较高的准确性。     

利用线粒体DNA Cyt b基因PCR-RFLP分析方法鉴别羊肉和鸭肉

建立了一种利用线粒体DNA(mtDNA) Cyt b基因PCR-RFLP分析来鉴别羊肉和鸭肉的方法。采用一对通用引物扩增绵羊、山羊和鸭的mtDNACytb基因,并对扩增产物用DNA限制性内切酶Bsu36I和SpeI进行酶切,电泳分析酶切产物的变化。结果表明通用引物可扩增羊和鸭472bp的PCR产物,经两种内切酶酶切后,绵羊、山羊和鸭的PCR产物分别被切为大小不同的片段,其中绵羊和山羊被SpeI切为213bp和259bp,而鸭则被Bsu36I切为95bp和377bp。利用PCR-RFLP分析mtDNA Cyt b基因的方法操作简单,是一种快速鉴别羊肉和鸭肉的可靠方法。     

应用实时荧光PCR技术量化检测羊肉中猪源性和鸡源性成份

目的建立羊肉中猪源性成份和鸡源性成份的定量检测方法。方法以新鲜羊、猪和鸡瘦肉为样本提取DNA分子作为检测模板,针对基因组中单拷贝基因设计特异性的引物和探针,应用荧光实时定量PCR技术对模板DNA进行扩增。通过绘制扩增标准曲线和确定羊、猪和鸡的质量与DNA比值常数,对4种不同掺混比例的混合肉样进行定量分析。结果检测质量百分比的绝对误差可以控制在7%以内,量化结果基本准确。结论对于组织成份单一的样品,可以通过在基因组单拷贝基因上设计特异性的引物,利用PCR技术实现在质量水平上对食品中动物源性成份的量化分析,该技术方法的建立可以为肉类掺假的监管工作提供有力的技术支撑。     

食品中动物源性成分的多重PCR快速检测

目的利用多重PCR技术对市售的多种食品进行检测,确定动物源性成分的种类,进行掺假及真伪鉴别。方法对鸡、猪、牛、兔、绵羊、山羊、马、鹿8种动物源性产品进行DNA提取,根据不同动物线粒体DNA设计特异性引物,根据脊椎动物细胞色素b基因mt DNA序列设计通用引物作为内源参照,对8种动物源性产品的DNA进行多重PCR扩增,同时对多种成分进行鉴定。结果琼脂糖凝胶电泳表明,此方法能同时扩增出8种动物的特异性条带,检测灵敏度达到0.01%。结论所建立的鉴定多种动物源性成分的新方法,操作简便、快速准确,可为各检验机构对食品进行检测提供方法指导。     

饲料中六种动物源性成分多重PCR快速检测方法

采用试剂盒对含有牛、羊、猪等6种动物源性成分饲料中的DNA进行提取,根据动物线粒体DNA序列设计引物.以18 s rRNA作为内源基因对照,对DNA提取产物进行6种动物源性成分多重PCR扩增,同时对6种动物源性成分进行特异性鉴定.结果分别扩增出6种动物的特异性条带,证明该多重PER方法具有较高的特异性和灵敏度.     

SN/T 2980-2011在动物源性成分检测中的适用性分析

目的 探讨行业标准SN/T 2980-2011《动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分三重实时荧光PCR检测方法》在动物源性成分检测中的适用性。方法 基于中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2980-2011和国家标准GB/T 25165-2010《明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法》对鲜肉组织及加工肉制品进行动物源性成分检测实验, 建立依托上述标准的动物源性成分检测能力。结果 SN/T 2980-2011中牛源性成分检测特异性不佳, 山羊源性成分检测特异性良好, 绵羊探针仅适用于单通道实时荧光PCR检测; GB/T 25165-2010中的牛、羊源性成分检测均展示出良好的特异性。结论 建议SN/T 2980-2011行业标准的起草单位及起草人重新设计适用于三重实时荧光PCR的牛、绵羊引物及探针,既要保证引物和探针的特异性也要保证适用性。     

基于线粒体DNACOⅠ基因鉴别畜禽肉中鸡源性成分

为建立畜禽肉中鸡源性成分的快速检测方法,以线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列为靶点,比较羊、牛、猪、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭、鹅9种动物COⅠ基因的差异位点,设计筛选鸡特异性引物,进行常规聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和荧光定量PCR检测。结果表明:所设计的引物仅对鸡肉DNA模板有扩增条带和典型扩增曲线,且循环阈(cycle threshold,Ct)值为21.78,对其他动物DNA模板无扩增。方法特异性较强,灵敏度较高,达pg级,可以用于畜禽肉与肉制品中鸡源性成分的快速、有效、准确检测。     

COI序列应用于羊肉掺伪非定向筛查技术的研究

本项目研究了应用COI序列对羊肉中掺入的其他动物源材料进行非定向筛查,并对山羊肉及绵羊肉进行分辨。利用了DNA条形码技术对六个羊品种(系)的线粒体基因组细胞色素酶基因片段进行引物筛选,并利用筛选出的引物对七种动物源样本的COI片段进行扩增,以确定所筛选出的引物是否能将羊肉与其他动物源样品进行有效区分。以LCOI490/HCO2198、F1-1/R1-1、ITS3/ITS4为引物,通过对36份血液样本(山羊3个品种,绵羊3个品种)的基因组DNA进行PCR扩增,其中以F1-1/R1-1为引物得到的PCR产物电泳检测条带清晰,结果重现性好;利用F1-1/R1-1引物对鸡肉、猪肉、驴肉、牛肉、莱芜黑山羊肉、洼地绵羊肉和鸭肉等七种样本的COI片段进行扩增,并对扩增片段进行测序,山羊、绵羊之间的序列同源性仅为36.62%,其他各品种间的序列差异也很明显。结果表明:以F1-1/R1-1为专用引物可以有效区分羊肉与其他动物源样品,并能够对山羊肉及绵羊肉样品进行有效区别。     

荧光PCR法检测畜禽肉中的鸡源性成分

为了建立畜禽肉中鸡源性成分荧光定量PCR检测方法,以鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊、兔、鸽和鹌鹑等9种动物线粒体DNA 16S rRNA基因序列为靶位点,通过比对分析设计筛选出鸡特异性引物,以9种动物肌肉DNA为模板进行特异性扩增,确立荧光定量PCR扩增条件;同时将鸡DNA模板浓度进行10倍梯度稀释,一直稀释至108倍,检测所建立的荧光PCR方法的灵敏度;并用此方法对市场上样品进行随机抽检。结果显示:所设计的鸡引物仅对鸡肉DNA模板有典型扩增曲线,Ct值为22.11,对其它动物DNA模板无扩增,特异性较强;当鸡DNA模板稀释倍数达到104倍,即DNA浓度为17.5 pg/μL时,仍有典型扩增曲线,Ct值为30.37,方法灵敏度较高;市场流通环节样品抽检结果显示所抽测样品均合格。可见,建立的基于荧光定量PCR和线粒体DNA 16S rRNA基因的畜禽肉中鸡源性成分检测方法,快速而准确,实用性强。     

实时荧光PCR技术快速检测奶制品中掺入的大米源性成分

目的:建立基于实时荧光PCR技术的奶制品中掺入大米源性成分的快速检测方法。方法:以水稻的根部表达基因(gos9)为靶基因设计特异性引物和探针,经特异性实验和灵敏度实验验证引物探针可行性,并经模拟含大米奶粉及市售奶类制品检测验证其实际检测能力。结果:该引物探针体系只针对大米DNA进行扩增,与奶类主成分牛、羊及其它谷类和植物性食物DNA均无交叉扩增;最低能检测到0.1ng的大米DNA,对含大米粉的模拟混合奶粉样品,检出限可达0.1%(W/W)。将其应用于21份市售奶制品样品检测,对含大米源性成分的奶制品扩增阳性,检测结果与食品标签相符。结论:该实时荧光PCR检测体系具有快速、特异、灵敏的优点,可以准确鉴定出奶制品中大米成分,适用于奶类中掺加大米源性成分的检测。     

转基因大米TT51-1品系精准定量检测方法的比较研究

基于大米蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因和TT51-1品系特异性基因序列筛选适用于数字PCR的内、外源基因特异性引物探针并建立转基因大米TT51-1品系的双重数字PCR定量方法。其定量的绝对灵敏度和相对灵敏度分别达2 copies/μL和0.1%。当样品中TT51-1转基因大米成分含量低至0.1%时,6次定量值的相对标准偏差在7.30%~18.63%之间,偏差在-8.77%~9.62%之间,精密度和稳定性均较为理想,而同样的引物探针所建立的实时荧光PCR方法定量的相对灵敏度仅达到1%。为促进该方法的标准化应用,将微滴式数字PCR平台上建立的定量方法在芯片式数字PCR平台上进行室内验证,结果表明该方法的定量精密度和准确性符合要求。该方法可应用于大米、稻谷及其初加工产品中TT51-1转基因大米成分的精准定量检测。     

肉制品中羊源性成分的定性和定量检测

通过检测肉制品中DNA的来源进行动物源性检测是打击鲜肉及加工肉制品制假掺假的重要技术手段。依据GB/T 25165—2010《明胶中牛、羊、猪源性成分定性检测方法 实时荧光PCR法》合成用于TaqMan 实时荧光聚合酶链式反应的引物和探针,利用鲜肉及加工肉制品进行羊源性成分定性和定量检测方法研究。首先利用12 种不同动物鲜肉组织的DNA检测方法的特异性,然后以羊源DNA梯度稀释液为模板进行灵敏度实验,最后在加工肉制品中检测方法的适用性和定量检测能力。结果表明：此方法具有羊源性成分检测特异性,对其他动物来源的鲜肉DNA均无扩增信号,可以检出羊肉和猪肉混合样品中0.1%的羊肉;方法灵敏度高,可以检出10 pg的羊源DNA;方法适用性广,可以对加工肉制品（羊肉干）进行羊源性成分的定性和定量检测。     

基于微滴式和芯片式数字PCR技术的转基因克螟稻成分的定量检测

以转基因克螟稻品系为研究对象,通过大米内源蔗糖磷酸合成酶基因和转基因克螟稻品系特异性序列的绝对拷贝数分析,建立转基因克螟稻成分的双重数字聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）定量分析方法。本研究中转基因克螟稻定量体系中最适DNA添加量在10 pg～13 ng之间,模板断裂程度、PCR扩增退火温度等因素对定量结果的影响不大。其定量的绝对灵敏度达1 copies/μL,可在微滴式和芯片式数字PCR平台上准确检测质量分数在0.1%～100%之间的转基因克螟稻成分,尤其是对低于1%的样品,其定量准确性高于传统的实时荧光PCR方法。本研究建立的转基因克螟稻成分定量分析方法适用性较好,可用于转基因水稻规范化与标准化的定量分析。     

微滴式数字聚合酶链式反应定量检测食品中金黄色葡萄球菌方法的研究

目的 建立微滴数字聚合酶链式反应(ddPCR)快速定量检测食品中金黄色葡萄球菌的方法。方法 以金黄色葡萄球菌nuc基因为靶序列,筛选出同时适用于实时荧光定量PCR(qPCR)和微滴数字PCR(ddPCR)的引物探针,建立食品中金黄色葡萄球菌ddPCR快速定量检测方法,并对该方法进行特异性、灵敏度、准确性和重复性实验。结果 梯度稀释金黄色葡萄球菌纯培养液,确定ddPCR方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)均为110 CFU/mL;通过人工添加实验,同时进行ddPCR与平板计数检测,LOQ可达1 000 CFU/g,且4个添加水平的检测结果偏差最大为4.77%,5个平行重复的检测变异系数均小于20%,展现出良好的准确性和重复性。结论 本研究建立的金黄色葡萄球菌ddPCR定量检测方法特异性好、灵敏度高、结果准确,为快速定量检测金黄色葡萄球菌提供了参考。     

微滴式数字PCR技术定量检测发酵乳中金黄色葡萄球菌

基于微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,dd PCR)技术,建立发酵乳中金黄色葡萄球菌定量检测方法。以金黄色葡萄球菌nuc基因为目的片段设计特异性的引物和探针,优化反应体系,通过活菌提取和ddPCR方法对靶标基因的检测特异性和灵敏度进行实验,并对定量结果进行分析。本研究建立了发酵乳中ddPCR技术定量检测金黄色葡萄球菌的方法,检测特异性良好,检测灵敏度为3.3×10~1 CFU/g,定量的偏差率为+10.18%,证明了ddPCR用于绝对定量检测的可行性,为其他食品污染菌和致病菌标准化控制体系提供有益的示范作用。     

微滴式数字PCR定量检测转基因玉米品系VCO-01981-5

建立基于QX100微滴式数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)平台的我国未批准转基因玉米品系VCO-01981-5的二重微滴式数字PCR定量检测方法。该方法选择基因组中单拷贝的玉米内源基因hmg和VCO-01981-5品系边界序列为定量靶序列,分别设计不同的PCR扩增引物和TaqMan探针,并对两种探针用不同的荧光进行标记,然后将上述探针和引物置于同一个PCR反应体系中以同时定量两个靶标序列。特异性实验结果显示该法只有VCO-01981-5品系的两个靶序列才都有扩增信号。灵敏度、线性和准确性实验结果显示在定量结果相对标准偏差不大于25%时,最低可稳定定量5个拷贝的VCO-01981-5品系特异性序列分子和4个拷贝的内源基因hmg分子;而在高达50 ng模板DNA以下范围内,PCR反应模板量与测定样品拷贝数之间呈高度正相关,相关系数达0.99以上;平均误差小于10%。结果表明本研究建立的该玉米品系定量方法特异性强,稳定性好,精确性、准确性以及灵敏度高,定量范围广,可用于进、出口农产品和食品中该转基因玉米品系成分的定量检测。此外,该法还可为其他转基因玉米品系及其他转基因作物品系建立类似定量检测方法提供参考。     

肉制品中牛源性成分Taqman荧光定量PCR检测法的建立

本实验根据牛线粒体差异序列设计特异性PCR引物和Taqman探针,并基于16S rDNA内参基因设计通用引物及Taqman探针,绘制并通过标准曲线确定样品中总DNA浓度以及牛源性成分DNA浓度,采用相对定量法测定肉制品中牛源性成分的质量分数。并通过特异性、灵敏度实验,及混合肉样回收率及市售肉制品检测,对本方法进行验证。结果表明,方法特异性强,可对牛肉DNA进行特异性扩增。最低检出限为10 pg/μL,具有较高的灵敏度。并根据回收实验可知,平均回收率为98.62%。可以为肉制品中牛肉含量的测定提供技术参考。     

微滴数字PCR方法检测畜肉食品中鸭源性成分

目的利用微滴数字PCR技术,建立鸭源性成分的快速、特异、灵敏检测方法。方法根据鸭线粒体基因全序列设计的引物及探针,利用微滴数字PCR进行扩增,建立鸭源性成分检测方法;以市场中常见畜禽肉为参考物种作微滴数字PCR特异性检测;以羊肉为干扰物观察微滴数字PCR的抗干扰性;将鸭肉DNA进行梯度稀释,对方法灵敏度进行检测。结果该方法能够有效对鸭源性成分进行检测,特异性强,灵敏度高,并且其他物种成分的存在对方法灵敏度检测没有影响。结论该方法特异性强,灵敏度高,可以实现畜肉食品中的鸭源性成分检测。     

一种基于实时荧光聚合酶链式反应的肉及肉制品中猪源性成分含量测定

为了建立一种基于实时荧光聚合酶链式反应的肉及肉制品猪源性成分含量测定方法,分别以猪线粒体DNA的NADH4基因和16S rRNA基因为靶位点设计猪特异性引物、探针和通用引物、探针,建立猪源性成分含量测定方法,通过特异性、灵敏性、线性、准确度及市售肉制品检测,对该方法体系进行检验和评价.结果表明:建立的猪源性成分含量实时荧光聚合酶链式反应测定方法体系具有良好的特异性及灵敏性,最低可检测到0.4pg/μL纯猪肉DNA;无论是猪特异性体系还是通用体系都呈现良好的线性关系(R2均达到0.999以上)和较宽的线性范围;通过含猪源性成分的模拟混合肉样检测,样品猪源性成分含量的回收率平均值为122.27％,说明该方法具有较高的准确度;通过市售肉制品检测表明该方法可以用来检测实际样品(包括生鲜样品和熟肉样品)中猪源性成分含量.     

多重实时荧光定量PCR同时检测冷冻蔬菜中4种食源性致病菌

目的 建立一种基于TaqMan探针的多重实时荧光定量PCR(multiplex quantitative real-time PCR, multiplex qPCR)同时检测冷冻蔬菜中4种食源性致病菌的方法。方法 针对金黄色葡萄球菌nuc基因、痢疾志贺菌rfc基因、沙门氏菌invA基因、单增李斯特氏菌hly基因, 设计4对引物和探针, 优化反应体系, 建立稳定的多重qPCR反应体系。通过阳性菌株污染的方法验证体系的特异性, 并确定了冷冻蔬菜样品在细菌水平的检出限。结果 各对引物和探针对目标菌有较强的特异性, 对其他非目标菌进行检测均未检出, 人工污染冷冻蔬菜中志贺菌的检出限为102 CFU/g, 沙门氏菌和单增李斯特氏菌的检出限均为103 CFU/g, 金黄色葡萄球菌的检出限为104 CFU/g。结论 本研究可以实现冷冻蔬菜样品中4种致病菌qPCR高效检测。