筛选用于四川泡菜生物保鲜的产细菌素乳酸菌（英文）

从8 种中国传统四川泡菜中筛选产细菌素的乳酸菌,以用于四川泡菜的生物保鲜。从四川泡菜样品中共分离出227 株乳酸菌,并筛选出8 株能够产生细菌素类化合物抑制英诺克李斯特氏菌(Listeria innocua)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)生长的乳酸菌。其中Lactobacillus harbinensis B22、屎肠球菌E6(Enterococcus faecium E6)和植物乳杆菌E11(Lb. plantarum E11)能够产生抑制革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)生长的细菌素类化合物。进一步研究表明,这3 株乳酸菌耐酸、耐高盐,能够在四川泡菜模拟培养基中生长并产生耐酸耐高温的细菌素类化合物。结果表明,Lactobacillus harbinensis B22、屎肠球菌E6和植物乳杆菌E11可用于四川泡菜的生物保鲜。     

清香型白酒酒醅发酵菌株分离鉴定及细菌群落结构分析

采用纯培养技术对清香型白酒酒醅中的乳酸菌和芽孢杆菌进行分离鉴定,同时通过Illumina MiSeq高通量测序技术解析清香型白酒酒醅细菌群落结构。结果表明,所有酒醅样品共分离得到13株乳酸菌,分别鉴定为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）4株、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）3株、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）3株、粪肠球菌（Enterococcus faecium）2株以及希尔氏乳杆菌（Lactobacillus hilgardii）1株。从酒醅中分离得到的17株芽孢杆菌菌株分别鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）9株、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）2株、短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）2株、澳洲芽孢杆菌（Bacillus australimaris）2株、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）1株以及蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）1株。Illumina MiSeq高通量测序技术结果显示,酒醅中优势菌门分别为厚壁菌门（Firmicutes）（97.96%）、放线菌门（Actinobacteria）（1.24%）和变形菌门（Proteobacteria）（0.76%）;优势细菌属为乳酸杆菌属（Lactobacillus）（97.42%）、栖热嗜油菌属（Thermoleophilum）（1.22%）和假单胞菌属（Pseudomonas）（0.72%）。     

云南传统腌制食品可培养乳酸菌多样性及其发酵特性研究

以云南传统腌制食品为研究对象,采用纯培养分离、形态学观察及分子生物学鉴定方法进行乳酸菌多样性考察,并对分离菌株进行了发酵特性初步研究。结果表明,云南传统特色腌制食品中可培养乳酸菌多样性强,从11个样本中分离得到10株优势乳酸菌,涵盖乳杆菌属（Lactobacillus）、明串球菌属（Leuconostoc）、肠球菌属（Enterococcus）的菌株,分别为短乳杆菌（Lactobacillus brevis）1097b、哈尔滨乳杆菌（Lactobacillus harbinensis）1119b、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）1128b、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）1133b、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）1116b、1125b、1126b、1127b、肠系膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）1089b、粪肠球菌（Enterococcus faecium）1129b;另外,不同分离源的乳酸菌发酵特性差异显著,乳酸发酵类型多样性丰富。     

不同来源酒曲酿制米酒中乳酸菌的分离与鉴定

为了研究湖北孝感和四川成都地区米酒曲中乳酸菌的多样性,该研究利用孝感凤窝米酒曲和成都农家自制米酒曲制作米酒, 并采用改良MRS固体培养基和分子生物学技术对米酒中的乳酸菌进行分离、鉴定。结果表明,从孝感米酒中共分离出42株乳酸菌,隶属于7个种,分别为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、融合魏斯氏乳酸菌（Weissella confusa）、植物乳杆菌（Lactobacillus plan- tarum）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）、能动乳杆菌（Lactobacillus agilis）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）和乳酸乳球菌（Lac- tococcus lactis）;从成都米酒中共分离出35株乳酸菌,隶属于7个种,分别为P. pentosaceus、W. confusa、L. plantarum、E. faecium、食窦魏 斯氏乳酸菌（Weissella cibaria）、约汉逊氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）和短乳杆菌（Lactobacillus brevis）。两种米酒中分离出的相同菌种为P. pentosaceus、W. confusa、L. plantarum和E. faecium。其中,P. pentosaceus为两种米酒的优势菌株。     

南宁地区米酒曲源乳酸菌在糯米汁中氨基酸和有机酸代谢特征研究

该研究采用纯培养技术对广西省南宁地区米酒曲中乳酸菌多样性进行了解析,旨在揭示其分离株在糯米汁中产氨基酸和有机酸的特征。结果表明,11个样品共分离出20株乳酸菌,分别被鉴定为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、融合魏斯氏菌（Weissella confuse）、类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、台湾乳球菌（Lactococcus taiwanensis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）,其中戊糖片球菌（P. pentosaceus）占分离株的35%,为南宁地区米酒曲中的优势乳酸菌。选取除屎肠球菌（E. faecium）外的16株乳酸菌分离株进行糯米汁纯种发酵,结果发现所有菌株均不产氨基酸,乳酸为糯米汁中主要有机酸。主成分分析（PCA）结果表明,融合魏斯氏菌（W. confuse）HBUAS53367产有机酸的能力较强,可用于后续进一步研究。     

内蒙古传统发酵乳制品中乳酸菌的分离及其耐药性研究

以内蒙古通辽地区自制的奶豆腐和酸性奶油（乌日莫）为材料,采用稀释涂布法从中分离乳酸菌,通过分子生物学技术对其进行菌种鉴定,并对其耐药性进行研究。结果表明,共分离纯化得到80株乳酸菌,经鉴定,归属于13个种,分别为短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、乳酸片球菌（Lactobacillus acidilacticii）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、食二酸乳杆菌（Lactobacillus digitalis）、奥塔基乳杆菌（Lactobacillus ottaki）、耐久肠球菌（Enterococcus durans）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、开菲尔乳杆菌（Lactobacillus kefir）,表现出高的生物多样性。80株乳酸菌对萘啶酸的耐药率为100%;对链霉素、环丙沙星、万古霉素的耐药率较高,分别为95.00%、80.00%、72.50%;对利福平和四环素的耐药率中等,分别为51.25%,45.00%;对红霉素、氯霉素的耐药率较低,分别为26.25%、23.75%。此外,76株（95%）的乳酸菌还具有多重耐药性。     

臭豆腐乳酸菌多样性及耐酸乳酸菌的筛选分离

对采集的8个不同地区的臭豆腐样品中的乳酸菌多样性分析表明,臭豆腐中乳酸菌数量在6.8×104cfu/g～2.9×106cfu/g,优势乳酸菌包括乳杆菌、乳球菌和肠球菌.通过乳酸菌耐酸特性比较,表明不同来源样品中乳酸菌耐酸差异性不明显,而不同种类乳酸菌的耐酸差异性较明显,肠球菌耐酸性比例高,乳杆菌其次,乳球菌最低.经筛选获得pH 3.0、37℃培养6 h后存活率超过30%的菌株6株,对其中2株耐酸最强的杆菌和球菌进行鉴定,分别为植物乳杆菌和屎肠球菌.     

贵州泡菜中乳酸菌的分离鉴定及其在泡菜发酵中的应用

以贵州遵义市采集的不同家庭自制的11份发酵泡菜制品为材料,从中筛选产酸量较高的乳酸菌,通过形态观察、生理生化试验及分子生物学技术对其进行鉴定,并对其耐酸、耐胆盐、耐盐及抑菌性能进行测定,筛选性能优良的乳酸菌,最后将其应用到发酵泡菜中。结果表明,筛选得到11株产酸量较高的乳酸菌,产酸量均＞1.89 g/L,经鉴定5株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）,6株为副植物乳杆菌（Lactobacillus paraplantarum）,其中菌株A50f7和A50b9的耐酸、耐胆盐、耐盐及抑菌性能优良。人工接种这两株乳酸菌发酵泡菜,能显著缩短泡菜发酵周期,改善泡菜的品质。     

江西酸芋荷中乳酸菌的分离鉴定及在泡菜发酵中的应用

以江西省赣州客家常见传统发酵食品酸芋荷为样品,采用MRS-碳酸钙培养基筛选出具有明显溶钙圈、产酸量较大的15株细菌。通过生理生化特征分析及16S rRNA基因序列比对、构建系统发育树,鉴定为8株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）,5株短乳杆菌（Lactobacillus brevis）,2株干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）。对15株乳酸菌进行耐酸、耐胆盐、耐盐能力测定,筛选得到性能优良的乳酸菌菌株A03c4、A03d1。人工接种乳酸菌A03c4、A03d1发酵泡菜,缩短了发酵时间,改善了传统发酵泡菜的品质。本研究为乳酸菌泡菜发酵剂开发的菌种选育提供了依据。     

丹江镇辣椒红酸汤细菌菌群多样性分析及抗食源性致病菌乳酸菌筛选

以贵州丹江镇传统辣椒红酸汤为研究对象,采用Illumina MiSeq高通量测序技术进行细菌菌群多样性分析,结合微生物纯培养技术和双层平板法从中分离优势乳酸菌,通过分子生物学技术对其进行菌种鉴定,并筛选抗食源性致病菌乳酸菌。结果表明,辣椒红酸汤样品中的优势细菌门为厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）;优势细菌属为乳杆菌属（Lactobacillus）。从辣椒红酸汤样品中共分离得到17株乳酸菌,经鉴定,11株为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、3株为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、1株为副干酪乳杆菌亚种（Lactobacillus paracasei subsp.）、1株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、1株为乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）,其中4株乳酸菌具有较好的产酸和抑菌性能,且干酪乳杆菌ST7-14的抑菌能力最好,对蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）ST2-1和阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）ST2-6的抑菌圈直径分别为37.0 mm和31.5 mm。     

不同盐质量浓度四川泡菜腐败前后微生物的分析比较研究

研究不同盐质量浓度四川泡菜正常发酵后与发生腐败后盐卤中微生物的数量、分布及变化。利用不同的选择培养基对3 个盐质量浓度四川泡菜腐败前后盐卤中的微生物进行分离纯化,得到168 株菌株,并经16S rDNA和18S rDNA分子生物学鉴定其种属。结果表明：在不同盐质量浓度泡菜正常发酵过程中,以植物乳杆菌和戊糖乳杆菌为主的乳酸菌主导了泡菜发酵过程。泡菜腐败时,不同盐质量浓度泡菜中的腐败微生物以芽孢杆菌和酵母为主,其中枯草芽孢杆菌和塔克斯假丝酵母在不同盐质量浓度泡菜腐败时均占一定比例;40 g/L盐质量浓度泡菜盐卤以甲级营养型芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、库德里阿兹威毕赤酵母和热带念珠酵母为主,60 g/L盐质量浓度泡菜盐卤以短小芽孢杆菌、克鲁维毕赤酵母和热带念珠酵母为主,80 g/L盐质量浓度泡菜盐卤以奇异变形杆菌、解淀粉芽孢杆菌、白地霉、地衣芽孢杆菌、库德里阿兹威毕赤酵母以及克鲁维毕赤酵母为主。腐败泡菜盐卤表层的膜璞由细菌和真菌共同形成,且盐质量浓度越低,细菌所占的比例越高。     

内蒙古奶豆腐中潜在益生性乳酸菌的筛选

对从内蒙古奶豆腐中分离的16 株乳酸菌进行16S rDNA分子鉴定,其中9 株鉴定为乳酸片球菌、5 株为屎肠球菌、1 株为植物乳杆菌、1 株为鼠李糖乳杆菌。进一步对分离得到的菌株进行模拟人工胃液和胆盐耐受性、疏水性、体外降胆固醇和抗氧化特性研究。结果表明：植物乳杆菌M1-2和鼠李糖乳杆菌M6-1对模拟人工胃液有较高的耐受性;屎肠球菌M7-1、M8-1和M8-2具有较高的胆盐耐受性;植物乳杆菌M1-2和鼠李糖乳杆菌M6-1对甲苯和十六烷的疏水性显著高于其他菌株。体外功能性实验结果表明,屎肠球菌M1-1、植物乳杆菌M1-2、乳酸片球菌M1-3和M2-1的体外降胆固醇能力较高,胆固醇降解率均超过30%;鼠李糖乳杆菌M6-1对过氧化氢的耐受性、羟自由基（•OH）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基的清除能力最高。综上所述,植物乳杆菌M1-2和鼠李糖乳杆菌M6-1具有较好的益生特性,可作为今后开发功能性产品的潜在益生菌株。     

抑制口腔变异链球菌的乳酸菌筛选及其抑菌机理

利用乳酸菌能抑制有害菌的特性,从实验室保藏的乳酸菌中筛选能抑制口腔变异链球菌的菌株,并测定了筛选菌株的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）,以及其对变异链球菌菌膜形成和黏附性的影响,初步研究其抑菌机理。结果表明,有5 株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum） K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1对变异链球菌具有明显的抑制作用。4 株变异链球菌指示菌中,变异链球菌（Streptococcus mutans）1.2499、1.2500对植物乳杆菌比较敏感。植物乳杆菌K25对变异链球菌的抑制作用比其他4株植物乳杆菌的作用更明显,其MIC最低（1.25×107～2.50×107 CFU/mL）。同时,菌株K25对变异链球菌菌膜形成的抑制率较高,还显著地降低变异链球菌的黏附率。对菌株K25抑菌机理的初步研究表明,其代谢过程中产生的乳酸和过氧化氢起到了主要的抑菌作用。     

产胞外多糖植物乳杆菌的筛选及粗多糖的活性研究

通过观察乳酸菌菌落拉丝状况并测定其胞外多糖（exopolysaccharide,EPS）的产量,筛选出1 株所产EPS黏性好、产量高的乳酸菌AR307,经鉴定为植物乳杆菌。为得到更多的胞外多糖,对植物乳杆菌AR307的发酵条件进行优化,确定其在发酵温度32 ℃、发酵时间20 h条件下的产糖量为389 mg/L。在体外实验中,所得胞外多糖具有抑制HT-29肿瘤细胞活性、降低血糖水平的作用。     

Selection and Use of Phytate-Degrading LAB to Improve Cereal-Based Products by Mineral Solubilization During Dough Fermentation

ABSTRACT:  New producers of phytate-degrading enzymes, especially lactic acid bacteria (LAB), were used to improve mineral solubilization during dough fermentation. In all, among strains from different sources by microorganisms (150 lactic acid bacteria, 36 yeasts), 38 (24%) exhibited a clear zone around the colonies by hydrolyzing hexacalcium phytate contained in solid medium. When phytase-positive strains from plate assay were tested for phytase activity in liquid medium, 6 of the strains (37%) exhibited phytate-degrading activity in at least one of the 3 different media used. Of the LAB, the highest phytase values were found for  Enterococcus faecium  A86 (0.74 U/mL) and  Lactobacillus plantarum  H5 (0.71 U/mL). Two different starter cultures obtained by combinations of phytase-positive (phy+:  L. plantarum  H5 and L3,  Leuconostoc gelidum  A16, and  E. faecium  A86) or phytase-negative (phy−:  L. gelidum  LM249,  L. plantarum  H19, and  L. plantarum  L8) selected LAB strains, were used to measure mineral concentrations of iron, zinc, and manganese during dough fermentation. Although the 2 kinds of starter showed similar acidic values, the presence of phytate-degrading LAB strains increased mineral solubilization in comparison to the starter phy−.     

市售酸奶中乳酸菌耐药性及耐药基因的检测

为探讨酸奶中乳酸菌所携带耐药基因对人类健康的潜在影响,对市售酸奶中的乳酸菌进行分离和鉴定,并通过药物敏感性实验确定菌株的耐药谱,同时利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增技术调查链霉素、庆大霉素、磺胺类和四环素等耐药基因的分布情况。结果表明：25 份市售酸奶样品中共分离得到56 株乳酸菌,包括26 株德氏乳杆菌保加利亚亚种、3 株植物乳杆菌、2 株嗜酸乳杆菌以及25 株嗜热链球菌。药敏结果显示,31 株乳杆菌对链霉素（87.1%）、庆大霉素（80.6%）、环丙沙星（74.2%）和四环素（61.3%）的耐药率较高,对头孢菌素类则较为敏感;而25 株嗜热链球菌同样对链霉素的耐药率最高,达76.0%;其次分别为万古霉素（32.0%）、环丙沙星（32.0%）和四环素（20.0%）。56 株乳酸菌中共检出5 种不同的耐药基因,分别为链霉素耐药基因ant(6)（检出率1.8%）、庆大霉素耐药基因aac(6')-aph(2')（检出率7.1%）、四环素耐药基因tetM（检出率5.4%）以及磺胺类耐药基因sulⅠ（检出率14.3%）和sulⅡ（检出率1.8%）。受试的乳酸菌中共有13 株检出耐药基因,其中有4 株携带两种不同的耐药基因。长期以来被认为安全并广泛应用于发酵食品领域的乳酸菌可能成为潜在的耐药基因贮存库。     

辽宁传统发酵豆酱中乳酸菌及酵母菌分离鉴定

以采自辽宁省不同地区农家38 份传统发酵豆酱样品为试材,通过选择性培养分离出豆酱中的优势乳酸菌及酵母菌疑似菌株,再利用16S rDNA和26S rDNA D1/D2序列分析方法,对其进行初步鉴定并保藏。结果表明,14 个地区38 份样品中共分离到乳酸菌62 株,初步鉴定结果为L. plantarum 19 株、E. faecium 14 株、T. halophilus12 株、L. sakei 11 株、L. fermentum 4 株、P. pentosaceus 2 株。分离到酵母菌56 株,初步鉴定结果为Zygosaccharomyces 18 株、Candida 13 株、C. parapsilosis 14 株、D. hansenii 7 株、Debaryomyces 4 株。丹东市、沈阳市、阜新市等地区的样品中乳酸菌和酵母菌的多样性较好。     

Biodiversity of the microbial community in a Spanish farmhouse cheese as revealed by culture-dependent and culture-independent methods

The microbial diversity within Alberquilla cheese, made from a spontaneously fermented mixture of raw goats' and sheep's milk in the Alpujarra mountains (Granada, south-east Spain), has been studied by the classical culturing method and also by molecular analysis of community DNA. A collection of 206 isolates was obtained from the cheese on different selective/differential media, which were then re-grouped to 52 after randomly amplified polymorphic DNA (RAPD)-PCR analyses. Isolates on Man-Rogosa and Sharpe-agar (MRS), M17-glucose agar and Kenner Fecal (KF)-agar medium were identified by specific PCR or 16S rRNA gene sequencing and belonged mainly to the lactic-acid bacteria group. The predominant genus was Lactobacillus, which accounted for more than 50% of the isolates, the most abundant species being Lactobacillus paracasei, followed by considerably less quantities of Lb. plantarum and Lb. brevis. Other lactic-acid bacteria identified were Pediococcus urinaequi, Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuc. mesenteroides, Lactococcus lactis and even the enterococci Enterococcus faecium and E. devriesei. Cluster analyses of RAPD-PCR patterns revealed a high degree of diversity among the lactobacilli. The Gram-negative bacterial strains belonged mainly to Hafnia alvei species. The microbes occurring in Alberquilla cheese were also studied by PCR temporal temperature-gradient gel electrophoresis (TTGE) of the 16S rRNA V3 region and partial 16S rRNA sequencing of the TTGE bands. The results showed a major presence of lactic-acid bacteria closely related to Lc. lactis, Lb. paracasei, Lb. plantarum, Lb. brevis, Lb. acidophilus and Enterococcus sp. The non-lactic-acid bacterium detected was identified as Escherichia coli. All the Enterococcus strains showed great susceptibility to the most clinically relevant antibiotics, harbouring only the virulence gene efaAfm. On the basis of their antimicrobial activity against Listeria monocytogenes we chose two strains of Ln. mesenteroides that produced mesenterocin B105 and mesenterocin Y105, as revealed by PCR techniques.     

降胆固醇乳酸菌的筛选及其在内蒙古发酵香肠中的应用

通过对乳酸菌降胆固醇生物学特性及对发酵肉制品中胆固醇降解作用进行研究,结果表明,从内蒙古传统肉肠中分离筛选得到的8 株乳酸菌中,菌株X3-2B有较强的胆固醇降解能力。且在MRS培养基中添加3 g/L胆盐、20 g/L胆固醇和 20 g/L葡萄糖时菌株X3-2B的胆固醇降解能力最大,在不同培养基中发酵不同时间菌株X3-2B对胆固醇的降解能力显著高于标准菌株。在以菌株X3-2B为发酵剂的发酵香肠中,其胆固醇含量显著低于对照组。故菌株X3-2B可作为一株降胆固醇性能较好的肉制品发酵剂。     

Enzyme activities of lactic acid bacteria from a pearl millet fermented gruel (ben-saalga) of functional interest in nutrition

Lactic acid bacteria responsible for the fermentation of a pearl-millet based fermented gruel, ben-saalga, were investigated for enzyme activity in relation with the nutritional characteristics of gruels used as complementary foods for young children. Thirty pre-selected LAB from a set of 155 isolates were characterized principally for their ability to produce amylase, phytase and alpha-galactosidase. Two Lactobacillus plantarum strains (4.4 and 6.1) and three Lactobacillus fermentum strains (11.11.2, 3.7, 7.4) able to produce one or more of these enzymes were selected. Only weak amylase activity was found in the two Lactobacillus plantarum strains. alpha-amylase activity was associated with cells and was lower than 0.05 Ceralpha Units/ml. Phytase activity was detected in all five strains and was linked to the cell. The highest phytase activity was found in Lb. plantarum 4.4 and 6.1 (348.7 +/- 17.4U/ml and 276.3 +/- 51.4U/ml, respectively) and Lb. fermentum 7.4. (276.3 +/- 13.2U/ml). All strains displayed a cell-linked alpha-galactosidase activity. In a medium containing 2% glucose, the highest cellular activity was found in Lb. fermentum 3.7 (1441.1 +/- 133.7U/ml) and Lb. plantarum 4.4 (1223.1 +/- 148.3U/ml) after 6h of fermentation in the presence of stachyose, and in Lb. plantarum 4.4 (763.3 +/- 23.5U/ml) and Lb. fermentum 7.4 (346.7 +/- 14.8U/ml) after 24h of fermentation with raffinose. These results are consistent with previous observations showing that phytates and alpha-galactooligosaccharides decreased during the natural lactic acid fermentation of pearl millet slurries, and that partial starch hydrolysis can be performed by endogenous microflora provided a pre-gelatinisation step is included in the process.