双酶法催化玉米淀粉制备γ-CD

以玉米淀粉为底物,研究了来自于栖热水生菌的4α-糖基转移酶(4αGTase)和来自于嗜碱芽孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)作用于淀粉制备γ-CD的影响因素。结果表明:两种酶的添加方式为先加入4αGTase、再加入CGTase;γ-CD的最佳制备条件为底物质量分数5%,4αGTase加酶量4 U/g淀粉,CGTase加酶量8U/g淀粉,反应时间30 h。在此条件下γ-CD的得率最高为12.83%,比对照组提高了76.7%。     

利用来源于Paenibacillus macerans的α-CGTase突变体Y89D生产α-环糊精

对α- 环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase)突变体Y89D 制备α- 环糊精的影响因素进行初步研究。其因素包括淀粉种类(马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、可溶性淀粉)、加酶量、反应时间、pH 值、有机溶剂(乙醇、异丙醇、正丁醇、正癸醇)和温度。结果表明：选用5g/100mL 马铃薯淀粉、pH5.0、温度30℃、加酶量控制在 每克淀粉5U 左右,反应体系中加入体积分数5% 的正癸醇,反应6h 后,淀粉总转化率可达70%,其中α- 环糊精在产物中质量分数约为85%,转化产物中含有少量β- 环糊精(15%),而极少生成γ- 环糊精。因此,α-CGTase突变体Y89D 在制备α- 环糊精工艺中具有很好的工业化应用前景。     

Box-Behnken响应面法优化酶法制备α-环糊精及其分离纯化

以α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-cyclodextrin glycosyltransferase,α-CGTase)为催化剂,研究其作用于马铃薯淀粉产出α-环糊精的酶法生产工艺。通过单因素试验和Box-Behnken中心组合设计法设计响应面试验,分析不同条件对α-环糊精转化率的影响。试验结果表明,当α-CGTase的反应温度为50℃,pH值为5.5时,α-CGTase呈现最好的酶活性质,α-环糊精的转化率最高。反应体系中加入有机溶剂正癸醇,底物浓度为1.0%,加酶量为200 U/g淀粉,反应时间为14 h时,α-环糊精的转化率可达40.6%。通过水蒸气蒸馏法进一步分离纯化α-环糊精产物,经高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)鉴定分析,转化率可达到20%～40%,纯度达到75%。     

重组4-α-糖基转移酶转化淀粉制备大元环糊精的条件优化

4-α-糖基转移酶能够以淀粉为底物通过分子内转糖基作用制备大元环糊精。本研究成功构建了产超嗜热菌Aquifex aeolicus来源的4-α-糖基转移酶重组菌的E.coli BL21 (DE3)/pET-24a(+)-AaAM。对重组菌进行摇瓶发酵,培养27h破壁上清酶活达到0.99 U/mL。以马铃薯淀粉为底物,对酶转化生成大元环糊精进行了条件优化。结果表明,在底物质量浓度为1 g/dL时,经异淀粉酶脱支预处理后,调节初始pH为7.0,反应温度为75℃,加酶量为20 U/g,在10 h时大元环糊精的转化率达到最高24.8%,为大元环糊精的工业生产奠定了基础。     

β-淀粉酶酶解甘薯淀粉条件分析

麦芽糖可以诱导枯草芽孢杆菌产生中温α-淀粉酶,甘薯淀粉的β-淀粉酶酶解产物主要为麦芽糖。应用高效液相色谱示差折光检测法对不同酶解条件下甘薯淀粉β-淀粉酶酶解产物进行分析。结果表明,液化酶加入量为5~10U/g干淀粉时,酶解产物中葡萄糖的含量最高可达0.94%±0.048%,其含量较低,不会对枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶具有阻遏作用。酶解最佳条件为液化酶加入量5U/g干淀粉,β-淀粉酶最佳加入量为200U/g干淀粉,酶解最佳温度为60℃,最佳酶解时间为28h时,此条件下甘薯淀粉酶解产物中麦芽糖含量达75.8%±1.7%。甘薯淀粉β-淀粉酶酶解产物可以诱导β-淀粉酶酶解产物枯草芽孢杆菌发酵生产中温α-淀粉酶。研究对枯草芽孢杆菌发酵生产中温α-淀粉酶碳源优化具有重要意义。     

CGTase合成γ-环糊精的酶促反应条件优化

采用筛选到的一株嗜碱芽孢杆菌,研究它所产生的环糊精糖基转移酶生产环糊精的工艺条件,重点探讨酶促反应条件对环糊精糖基转移酶生产γ-环糊精的影响。结果表明:环糊精糖基转移酶生产γ-环糊精的最佳工艺为反应体系的pH 8.0,温度60℃,环糊精糖基转移酶的酶量500U/g.淀粉,甘草酸浓度2%,淀粉的DE值6～11,在该条件下制备的产品得率最高;蕉藕淀粉和木薯淀粉在生产γ-环糊精时是环糊精糖基转移酶比较合适的底物;普鲁蓝酶对γ-环糊精的产量增加作用有限。     

β-环糊精的合成工艺研究

通过对以麦芽糊精为底物,合成β-环糊精过程中工艺参数的研究,为环糊精生产提供参教指导。经试验得出最佳参数为：添加10％（V/V）环己烷,以DE5．80的麦芽糊精为底物,底物浓度15-20％（m／V）,反应温度50℃,反应pH8．5,加酶量5U/g淀粉,反应时间5～10h的条件下,β-环糊精得率最高。     

响应面分析法优化β-环糊精的制备工艺

该文对β-环糊精制备工艺用响应面分析法优化进行了研究。结果表明,生产β-环糊精的最佳条件是选取木薯淀粉作为底物,不经过预处理,环状糊精葡萄糖基转移酶添加量是7U/g,环己烷的添加量0.5mL/g,体系CaCl2的浓度是50mmol/L,pH值8.25,温度63.72℃,反应时间9.04h,产率可达51.98%。优化后的生产工艺和传统工艺相比,反应时间缩短了5h,并且产率增高了1.13倍。     

产环糊精葡萄糖基转移酶菌株的筛选、鉴定与应用研究

利用产环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)菌株快速筛选法结合芦丁转糖基酶反应,筛选获得一株所产CGTase可高效转化芦丁的菌株.16S rRNA鉴定表明,此菌株和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)有100%的同源性.结合形态和生理生化鉴定,确定此菌株为地衣芽孢杆菌,命名为Bacillus licheniformis SK13.002.该菌株在PH约为10时生长良好,且具有最高的产酶量,显示其嗜碱性.此菌株所产酶以淀粉作底物所产环糊精为β-环糊精和γ-环糊精,其中β-环糊精所占比例为83.3%;两者产量分别达到20.9g/L和4.2g/L.直接利用浓缩酶液进行芦丁的糖基化,则可以得到近70%的转化率.     

γ-环糊精葡萄糖基转移酶的酶学性质及其产物特异性

通过克隆Bacillus clarkii 7364来源编码γ-环糊精葡萄糖基转移酶(γ-cyclodextrins glucanotransferase,γ-CGTase)的基因,构建并表达基因重组菌株E.coli BL21/pET28a(+)-γ-CGTase,对γ-CGTase酶学性质和产物特异性进行了研究。结果表明,所克隆表达的γ-CGTase分子质量为78 kDa,水解活力与环化活力在最适温度、最适pH、金属离子影响等方面均存在一定差异。以可溶性淀粉为底物,经HPLC测定催化产物中几乎无α-环糊精(α-cyclodextrin,α-CD),γ-CD/β-CD可达7.70,γ-CD转化率为15.83%,添加体积分数为10%的乙醇浓度γ-CD产量可提高89.91%,γ-CD/β-CD提高73.77%,转化率为33.44%。催化豌豆淀粉γ-CD/β-CD达12.92,转化率为19.1%,分别比可溶性淀粉提高了63.13%和22.90%。该研究为进一步提高γ-CGTase酶法制备γ-CD产量和专一性应用提供了重要的理论依据。     

产β-环糊精葡萄糖基转移酶高温菌株HY15发酵条件优化

以一株产β-环糊精葡萄糖基转移酶（β-CGTase）的嗜热菌株HY15为研究对象,采用单因素试验研究碳源、氮源、初始pH值、培养温度、MgSO4·7H2O等对酶活力影响。并设计正交试验优化其发酵条件。结果表明最优的发酵条件为：碳源为玉米淀粉+糖蜜,氮源为玉米浆,初始pH7.0,培养温度60℃、摇床转速220r/min,MgSO4浓度10mmol/L,在此条件下,β-CGTase酶活力可达1794.3U/mL。     

重组β-半乳糖苷酶的制备及转化条件优化

以前期构建的产Bacilluscirculansβ-半乳糖苷酶重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-20b-lac为菌种,进行摇瓶发酵诱导培养,培养24 h胞外上清酶活达15 U/mL。利用制备的β-半乳糖苷酶粗酶液进行酶转化实验。优化了酶转化条件,考查了初始pH、反应温度、乳糖质量浓度、加酶量和反应时间等因素对低聚半乳糖产率的影响。确定最优转化条件为:初始pH 6.5、反应温度55℃,起始乳糖质量浓度为700 g/L,加酶量为8 U/mL。在此条件下反应16 h,低聚半乳糖转化率可达57%。     

环糊精葡萄糖基转移酶生产α-熊果苷的反应条件优化及分子改造

选择4种环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)分别为来源于Paenibacillus macerans的α-CGTase,Bacillus circulans 251的β-CGTase,Bacillus stearothermophilus NO_2和Anaerobranca gottschalkii的α/β-CGTase,研究不同种类的CGTase生产α-熊果苷的情况。以麦芽糊精为供体,对苯二酚(Hydroquinone HQ)为受体,通过CGTase和淀粉葡萄糖苷酶的两步酶法反应催化合成α-熊果苷。分别优化不同类型的酶合成α-熊果苷的条件,发现Anaerobranca gottschalkii来源的CGTase在如下最优条件下获得的HQ摩尔转化率最高,为25%:以葡萄糖当量(DE)值为9%~13%的50 g/L麦芽糊精作为供体,8 g/L HQ为受体,缓冲液pH 6.0,在40℃下反应24 h,沸水浴灭活后,加入糖化酶处理,高效液相色谱检测产物。为了进一步提高CGTase对底物的转化率,利用定点突变技术对A.gottschalkii CGTase进行分子改造,得到1个突变体Y299A,在最优的反应条件下突变体的HQ转化率可达40%。     

大麦β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中异源表达

该研究拟采用枯草芽孢杆菌异源表达大麦来源β-淀粉酶。选择枯草芽孢杆菌WB800作为宿主,采用同源重组的方法构建表达载体p P4 3NMK-amy B,获得重组枯草芽孢杆菌WB-amy B。重组枯草芽孢杆菌在摇瓶发酵条件下酶活最高可达386 U/m L,纯化后测得其比酶活为613 U/mg。重组酶的最适温度为55℃,最适p H值为5. 0。重组β-淀粉酶水解产麦芽糖能力与大麦β-淀粉酶相当,与普鲁兰酶联用时麦芽糖最大转化率可达81. 8%。重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵水平产酶量高于类似文献报道,重组β-淀粉酶的酶学性质与大麦β-淀粉酶相比几乎相同,完全可以替代大麦β-淀粉酶在工业上的应用。     

多黏芽孢杆菌产ɑ-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的可溶性表达及其转化产物特异性研究

通过设计简并引物,从Paenibacillus macerans YLW菌株中克隆到其α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase)基因,构建重组质粒α-CGTase-p ET28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),得到重组菌株α-CGTase-p ET28a/BL21(DE3)。在16℃,1m M IPTG条件下诱导15 h,实现了α-CGTase的可溶性表达,胞内酶活达到10046U/m L,是野生菌株胞外酶活的3.25倍。经镍柱一步法亲和纯化α-CGTase后,酶蛋白纯化了6.05倍,酶收率28.82%,通过SDS-PAGE检测获得表观电泳纯酶蛋白。酶催化转化实验表明:重组α-CGTase酶转化质量分数为5%的马铃薯淀粉15 h后,环糊精的总转化率可达40.7%,转化生成α-CD,β-CD,γ-CD比例分别为:43.6%、41.8%和14.6%。该重组酶对α-CD具有较好的转化专一性,通过转化条件的进一步优化将具有非常好的产业化开发前景。     

普鲁蓝酶逆向合成麦芽糖基β-环状糊精

以麦芽糖和β-环状糊精作为底物，利用酸性普鲁蓝芽孢杆菌普鲁蓝酶的逆向合成作用合成麦芽糖基β-环状糊精。产物经纸色谱、HPLC和IR进行鉴定并用纸色谱对其分离纯化。对可能影响麦芽糖基β-环状糊精合成的pH、反应温度、加酶量、麦芽糖与β-CD的摩尔比、底物浓度及反应时间等各因素分别作了单因素实验，确定最佳反应条件为温度70℃，pH值4．5，麦芽糖和β-环状糊精摩尔比为12：1，底物浓度80％～85％，加酶量200U/g β-CD，反应时间60h。     

普鲁兰酶逆向合成麦芽糖基-α-环糊精

以麦芽糖和α-环糊精作为底物,利用普鲁兰酶逆向合成作用合成了麦芽糖基-α-环糊精。用薄层色谱、液-质联用对产物进行了鉴定,并用薄层色谱对其分离。对影响麦芽糖基-α-环糊精合成的反应物摩尔比(麦芽糖/α-环糊精)、底物浓度、反应温度、反应时间、加酶量、pH等因素分别做了单因素实验,最终确定了反应条件:反应物摩尔比(麦芽糖/α-环糊精)为16:1,反应时间24h,反应温度为58℃,加酶量400U/gα-环糊精,pH4.5。     

响应面法优化重组大肠杆菌PUCRF发酵培养基的研究

为进一步提高重组大肠杆菌( PUCRF)产β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-CGTase)的酶活力,以构建的一株能在胞外分泌表达β-CGTase工程菌E.coli PUCRF 为出发菌株,利用响应面法对其发酵工艺条件进行优化。根据Box-Benhnken中心组合设计原理,在单因素试验基础上采用四因素三水平的响应面分析法确定重组大肠杆菌PUCRF最佳培养基组成(g/100mL)为：玉米淀粉 0.962、玉米浆0.097、MgSO4 ·7H2O 0.153、K2HPO4 ·3H2O 1.235。经过优化,β-CGTase产量可达3610U/mL,是初始条件下β-CGTase酶活力(2690U/mL)的1.34倍。     

半乳糖基-β-环糊精的合成与结构研究

以β-环糊精和蜜二糖为原料,通过α-半乳糖苷酶酶法合成得到半乳糖基β--环糊精(Gal-β-CD)。酶法合成条件为:蜜二糖中酶用量为20U/g,β-环糊精和蜜二糖的物质的量比为1:2,pH6.5(50mmol/L醋酸缓冲液),反应时间24h,反应温度40℃。经过高效液相色谱分离产物,通过质谱、红外光谱和核磁共振证明该产物为6-O-α-D-半乳糖基-β-环糊精。     

不同淀粉原料及前处理方法对β-环糊精生产的影响

为了获得β-环糊精生产的高转化率.通过对不同淀粉的比较,得出玉米淀粉具有较高的经济适用性;通过对不同前处理方法得到的淀粉生产β-环糊精转化率的比较,得出影响转化率的几个因素,分别是淀粉颗粒大小、淀粉的晶体结构的破坏程度和小分子糖的抑制作用;并得出将糊化淀粉作为底物最有利于环化反应的进行,但由于高粘度却无法工业化生产;通过研究,确定了一种新型的前处理方法,即将质量分数7%玉米淀粉浆在85℃下保温1 h,水浴摇床中65℃200 r/min转化24 h,获得了29.86%的高转化率,克服了大规模生产中糊化淀粉粘度过高无法搅拌均匀和酶解处理后的淀粉中小分子糖抑制作用的问题.