海洋产几丁质酶厦门加西利亚单胞菌Chi34的筛选、鉴定及酶学性质分析

目的：海洋是自然界中含几丁质最多的生态系统,孵育了大量可降解利用几丁质的微生物,因此利用海洋微生物几丁质酶降解几丁质,是获得高附加值几丁寡糖的重要方法。本试验以连云港海域海泥为样品,以期筛选获得稳定的产几丁质酶菌株。方法：利用平板筛选法和摇瓶发酵复筛法筛选获得产几丁质酶菌株Chi34,利用形态学分析和16S r DNA序列分析对菌株进行鉴定,同时还研究了温度、pH、金属离子、EDTA及SDS等因素对Chi34几丁质酶的影响,最后通过TLC实验分析了Chi34几丁质酶降解几丁质胶体的产物。结果：菌株Chi34鉴定为厦门加西利亚单胞菌(Gallaecimonas xiamenensis),其几丁质酶酶活力为0.631 U/m L,最适反应温度为35℃,最适反应p H为6.0,Na₊、Ca₂₊、Mn₂₊、K₊对Chi34几丁质酶具有显著的激活作用,Cu₂₊、Fe₃₊、Ba₂₊、Zn₂₊、Cd₂₊、...     

发光杆菌产几丁质酶的工艺优化

为提高海洋发光杆菌Photobacterium sp.LG-1产低温几丁质酶的酶活性,利用响应面法对其发酵产酶条件进行了优化。Plackett-Burman实验结果表明,影响菌株产酶的三个主要因素分别为发酵温度、发酵时间和酵母膏含量。菌株产酶的最适条件为:胶体几丁质浓度12.0 g/L、酵母膏浓度4.5 g/L、转速220 r/min、发酵温度20℃、装液量75 mL/250 mL、接种量1%、初始pH7.0、发酵时间120 h,几丁质酶的最大酶活为5.10 U/mL。实际平均酶活经验证与预测酶活相近,几丁质酶活比优化前提高了11.50%。为下一步低温几丁质酶的降解机制研究及在工业中的应用提供参考。     

双酶协同降解胶体几丁质及其作用机制

建立一种几丁质酶(chitinase,ChiA)和β-N-乙酰基己糖胺酶HJ5N协同催化体系,可实现一步反应降解胶体几丁质制备N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc),探讨不同因素对双酶协同催化体系的影响和双酶协同作用机制.结果表明,双酶协同催化体系的最适反应温度为30℃,最适反应pH...     

产黄青霉抗真菌几丁质酶的纯化及特性分析

为实现抗真菌性能的耐热新型几丁质酶在食品防腐及生物防治方面的应用，从产黄青霉Xch23中分离纯化几丁质酶（Chi-Pc76）并研究其应用特性。通过硫酸铵沉淀、DEAE-Cellulose A52离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析纯化得到均一的Chi-Pc76。最终得到Chi-Pc76纯化倍数17.1 倍，回收率21.6%，比活力为584.8 U/mg。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得Chi-Pc76分子质量61 kDa。纯化后的Chi-Pc76最佳反应条件为pH 6.0、温度55 ℃。Chi-Pc76在宽泛的pH 4.0～10.0之间稳定性强，其显著的热稳定性可达到70 ℃。Chi-Pc76对底物胶体几丁质具有高的底物特异性，对乙二醇几丁质、α-几丁质、β-几丁质有中等活性，而对其他受试底物无活性或痕量活性。以胶体几丁质为底物Km和Vmax值分别为0.25 mg/mL和20 μmol/（min·mg）。金属离子Ca2＋、Ba2＋、K＋、Na＋对酶有明显激活作用；十二烷基硫酸钠、吐温80、苯甲基磺酰氟和尿素对酶活力基本无影响，但Mn2＋、Co2＋、Fe2＋、Ag＋、Cu2＋、Zn2＋、Pb2＋、Hg2＋和β-巯基乙醇、二硫苏糖醇均对酶活力有抑制作用。Chi-Pc76对黑曲霉、黄曲霉、尖孢镰刀菌和橘青霉均有显著的抗真菌活性，对比文献为产黄青霉抗真菌几丁质酶。鉴于Chi-Pc76纯化简便、热稳定性好、宽广的pH值稳定性、高效降解几丁质和抗真菌等特点，产黄青霉Xch23几丁质酶在几丁质废料综合利用、生物转化药理活性产品、食品保鲜以及植物病原性真菌和昆虫幼虫生物防治等方面具有潜在价值。     

一株产几丁质酶渤海丝状真菌（Alternariatenuissima）的筛选及鉴定

以渤海湾水域获得的52株丝状海洋真菌为出发菌株,通过平板透明圈法和发酵液酶活性测定,从中筛选出一株产几丁质酶活力较高的海洋真菌mTJ04-1．1,结合形态学方法和18SrDNA．ITS序列分析对其进行鉴定,确定该菌为极细链格孢霉（AltemariatenuissimamTJ04-1-1）。该菌能在以几丁质为唯一碳源的平板上生长并产生明显透明圈,透明圈与菌落直径的比值（D／d）达N2．81。对发酵液几丁质酶活力分析结果表明,该酶最适反应温度为45℃,最适pH值为6．5,最适条件下酶活性可达3．2U／mL。     

绿僵菌Ma83固态发酵几丁质酶和部分酶学性质的初步研究

研究了金龟子绿僵菌MetarhiziumanisopliaeMa83菌株产几丁质酶的固态发酵条件和粗酶液的酶学性质。研究结果显示 ,当以麸皮∶蚕蛹粉为 3∶1作为培养基 ,最适氮源为1%NaNO3,起始pH为 6 5 ,发酵温度为 31℃ ,接种量为 2mL液态种子时酶活力最高。此外 ,添加稻壳对Ma83产几丁质酶有促进作用。该菌株在生长 2d时 ,酶活力达 33 9U /g干培养基。酶的最适反应温度为 5 0℃ ,最适反应 pH为 6 0 ;不同温度保温 1h后 ,酶的半失活温度为 42℃。不同 pH值的缓冲溶液中 (2 5℃ )放置 1h后 ,酶在pH 5 0～ 6 0条件下稳定性最高     

大肠杆菌表达几丁质酶对不同底物的酶学性质及其降解产物分析

采用重组大肠杆菌大量表达几丁质酶LICHI18A,经Ni-NTA柱纯化后,对不同底物的酶学性质进行了研究,以Lineweaver-Burk双倒数作图法测定米氏常数,采用薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)对降解产物进行分析。结果表明,该几丁质酶分子量为54 k Da,对水溶性壳聚糖的Km和Vmax分别为4.04 mg/m L和222.2μmol/(min·mg);对水溶性壳聚糖的反应最适温度和p H分别为60℃和7.0;对胶体几丁质的Km和Vmax分别为2.913 mg/m L和2.836μmol/(min·mg),反应最适温度和p H分别为40℃和5.0。Ni2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+对胶体几丁质的降解有明显的促进作用,但对水溶性壳聚糖的降解没有促进作用,且Ni2+和Zn2+有一定的抑制作用。Tween-80对降解胶体几丁质起一定的促进作用,而不同浓度的SDS有抑制酶活作用,且浓度越高抑制作用越强。TLC和HPLC分析结果表明,该酶降解胶体几丁质的产物主要为几丁二糖和单糖,而水溶性壳聚糖的降解产物较为复杂,主要有单糖、几丁二糖和甲壳寡糖。     

产低温几丁质酶菌株的筛选、鉴定与产酶条件优化

目的:筛选产低温几丁质酶菌株,并对其进行鉴定及发酵条件优化。方法:本实验以渤海海域海泥为样品,以胶体几丁质为唯一碳源,通过平板筛选法筛选产低温几丁质酶细菌,对其进行形态学鉴定和分子生物学鉴定,并对其发酵产酶条件进行了单因素优化。结果:菌株鉴定结果为发光杆菌(Photobacterium sp.),单因素优化结果为:胶体几丁质12.0 g/L、酵母膏6.0 g/L、发酵温度15 ℃、初始pH7.0、转速为220 r/min、装液量75 mL/250 mL、接种量1%、发酵时间96 h,酶活力达4.566 U/mL,比优化前提高389.91%。结论:为下一步酶学性质研究及低温几丁质酶在工业中的应用提供参考。     

海洋细菌来源几丁质酶的研究进展

海洋环境中有总量巨大的几丁质资源，细菌为主的海洋微生物能用产生的几丁质酶将长链几丁质水解为可利用单体，从而海洋维持碳氮循环的平衡，具有重要的生态意义。同时，工业上利用几丁质酶制备N-乙酰-D-氨基葡萄糖和几丁寡糖具有较大应用价值。迄今为止，研究者已鉴定了30多种海洋细菌所产的几丁质酶。本文着重介绍海洋几丁质的结构和来源、几丁质酶的作用方式和海洋细菌来源几丁质酶的催化性质，并且分析了几丁质酶在农业、医药和食品领域的应用。几丁质酶有望成为一种新型的工业酶制剂。     

响应面法优化海洋细菌产几丁质酶培养条件

目的:海洋细菌产几丁质酶培养条件优化。方法:在单因素试验的基础上,利用响应面法分析各因素之间的交互作用对几丁质酶产率的影响。结果:通过响应面试验得到最佳培养条件:温度为26.4℃,NaCl的百分浓度为3.39%,培养基初始pH值为6.3。结论:在最适产酶发酵条件下,菌株产几丁质酶的活性比优化前提高了5.4倍。     

酸橙内生菌Bacillus thuringiensis Bt028几丁质酶的分离纯化及其酶学性质

为揭示酸橙内生菌Bacillus thuringiensis Bt028几丁质酶的基本酶学性质,采用离心、硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶G-100层析及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法对菌株Bt028发酵液中的几丁质酶进行分离纯化鉴定,并考察该几丁质酶的最适温度、最适pH、催化动力学参数等性质。结果表明,Bt028菌株发酵液经离心、硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶G-100层析分离纯化后获得电泳纯几丁质酶比活力为681.78 U/mg,纯化倍数为3.21,回收率15.52%。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,几丁质酶的分子质量为65 kDa。酶学性质研究结果表明,该酶的最适反应温度为60 ℃,最适反应pH为6.5,在温度低于60 ℃、pH5.5~7.5时有较好的稳定性;Mg2+、Ca2+、Hg2+、Co2+对该酶活力有抑制作用,而Cu2+和Fe3+有一定的促进作用;低浓度的甲醇、乙醇、正丙醇和二甲亚砜使酶的活性增加,但当浓度继续增大,反而会抑制酶的活性;丙酮对几丁质酶有激活作用,而甲醛对几丁质酶有抑制作用。在最适催化条件下,几丁质酶催化反应的米氏常数Km、最大反应速率Vmax、酶的转换数Kcat分别为29.533 mg/mL、108.696 μmoL/(L·min)和0.527/min。研究结果可为该酶的实际应用提供必要的工艺参数。     

高温紫链霉菌酸性耐热几丁质酶的纯化及性质研究

从高温紫链霉菌Z16发酵液中分离纯化得到一种酸性耐热几丁质酶,并对其酶学性质进行了研究。粗酶液经硫酸铵沉淀和离子交换层析纯化后得到电泳级纯酶,酶活力回收率为22．3％,纯化倍数为12．7倍,比活力由2．9U／mg提高到36．8U／mg。SDS—PAGE和凝胶过滤测定纯酶的分子量分别为41．6ku和40．8ku,表明该酶为单亚基蛋白。酶学性质测定结果表明,该几丁质酶为酸性酶,最适pH为4．0,在pH3．0～6．0时保持较高的酶活力。该几丁质酶的最适反应温度为60℃且具有较好的温度稳定性,在55℃和60℃时的半衰期分别为267min和132．9min。该几丁质酶能够水解胶体几丁质,水解产物主要为N-乙酰氨基葡萄糖和几丁二糖以及少量的几丁三糖。该酶优良的酶学特性使其具有广阔的工业应用前景。     

金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae Ma83)几丁质酶的纯化及性质

由金龟子绿僵茵Ma83菌株产生的几丁质酶经硫酸铵盐盐析,Sephadex G-100柱层析,DEAE-纤维素柱层析分离纯化后,得到SDS-PAGE均一样品.酶的最适反应温度为50℃,半失活温度为65℃;酶的最适反应pH值为5.0,酶在pH4.0～7.0范围内较稳定.Ag+、Co2+、K+、Mg2+对Ma83几丁质酶有激活作用,而Hg2+、Zn2+、Pb2+对几丁质酶活力有抑制作用.经计算Ma83菌株几丁质酶对胶体几丁质的Km值为1.05 mg/mL.     

Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1几丁质酶的性质及在虾皮水解中的作用

以一株产几丁质酶细菌Chitinolyticbacter meiyuanensisSYBC-H1为材料,对几丁质酶进行了分离纯化及酶学性质研究。通过硫酸铵沉淀、DEAE-cellulose阴离子交换介质和SephadexG-100分子筛层析柱处理其所产几丁质酶,获取纯度为95%以上的几丁质酶。酶学性质表明,该酶的最适温度为40℃,最适pH值为6.5,在50℃以下较为稳定,在pH值为5.0时最稳定,β-巯基乙醇有利于防止半胱氨酸氧化而增加几丁质酶稳定性,EDTA可增加该酶稳定性,Na+,K+对几丁质酶有明显的激活作用,Zn2+,Mn2+,Fe2+,Fe3+对几丁质酶有较大的抑制作用。SYBC-H1几丁质酶可把虾皮水解为N-乙酰氨基葡萄糖,水解率为21.8%。     

黏质沙雷氏菌胞外几丁质酶的纯化及特性

黏质沙雷氏菌几丁质酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、DEAE-琼脂糖凝胶阴离子交换层析和苯基-琼脂糖凝胶疏水层析,得到电泳纯的几丁质酶和几丁质结合蛋白CBP21。该几丁质酶和CBP21分子质量分别约为58 ku和21 ku,CBP21对该几丁质酶水解几丁质增效明显。几丁质酶反应最适温度为50℃,最适pH约为6.5～7.0。该酶在55℃以下、pH 4.5～8.0范围内稳定。酶的Km值为0.22 mg/mL,Vm为1.26μmol/(min.mg)。金属离子K+、Sn2+、Mn2+对酶有一定激活作用,而Pb2+、Hg2+和Cu2+则强烈抑制其活性。该几丁质酶的糖基含量约为3.3%。EDTA和2-ME可分别提高酶活力65%和105%。H2O2强烈抑制酶活力,提示其活性中心可能存在硫氢基。     

Marinococcus sp·PS-1产几丁质酶发酵条件研究

筛选得到一株产碱性几丁质酶较强菌株,经鉴定为海球菌属(Marinococcus),编号PS-1。该菌产酶最适碳源体积分数为20%胶体几丁质,氮源为0·3%大豆粉,胶体几丁质对产酶有诱导作用。5L发酵罐实验表明,溶解氧是影响该菌株产酶的重要因素。通过提高通气量和改变搅拌速度,该菌株可在发酵72h内达到产酶高峰,酶活力最高达到0·56U/mL。     

链霉菌9-1-1产几丁质酶的发酵条件研究

从烟草根际土样中分离、筛选得到1株几丁质酶活性比较高的链霉菌9-1-1,为评价该菌株利用价值,对其发酵条件(碳源、氮源、初始pH、表面活性剂及发酵时间)进行了研究.结果表明:该菌株的最佳发酵条件以1%胶体几丁质为碳源,发酵液初始pH值为6.5,以1%蛋白胨为氮源,0.1%吐温80作为表面活性剂,发酵时间为96 h,接种量为1%,最高酶活达到56 U/mL.     

三株产几丁质酶菌株的筛选、产酶条件优化及水解虾壳的研究

目的:筛选鉴定产几丁质酶的菌株并优化其发酵条件,最终应用于虾壳降解研究。方法:以盐城市滩涂海泥为样品,利用平板筛选水解几丁质的菌株,运用生物信息学方法鉴定菌株,通过单因素优化其发酵条件,并将筛选得到的菌株和优化后的发酵条件用于虾壳发酵。结果:鉴定得到三株显著降解胶体几丁质的菌,分别是发光杆菌（Photobacterium sp. LYM-1）、需钠弧菌（Vibrio sp. WM-1）和希瓦氏菌（Shewanella sp. ZXY-1）;优化发酵条件:发光杆菌的碳源为几丁质10 g/L,氮源为NH₄Cl 2.0 g/L,接种量为3%,发酵液pH为6.5,温度为32 ℃,发酵1 d酶活最高为15.37±0.55 U/mL,是优化前的4.37倍;需钠弧菌的碳源为几丁质10 g/L,氮源为NH₄Cl 2.0 g/L,接种量为3%,发酵液pH为7.5,温度为22 ℃,发酵2 d酶活最高为40.82±6.03 U/mL,是优化前的1.60倍;希瓦氏菌的碳源为几丁质10 g/L,氮源为(NH₄)₂SO₄ 2.0 g/L,接种量为3%,发酵液pH为6.5,温度为22 ℃,发酵1 d酶活最高为25.64±3.29 U/mL,是优化前的2.47倍;三株菌均能利用虾壳产几丁质酶,但利用效率均低于几丁质,酶活力分别为10.25±0.95、32.16±2.25和21.81±4.27 U/mL。结论:本研究从盐碱地筛选得到三株产几丁质酶的菌株,优化后酶活力均得到提高,且均能利用虾壳产几丁质酶,为发酵虾壳制备几丁质酶提供新的菌株来源。     

单胞菌产几丁质酶的酶学性质研究

对从海水中分离得到的嗜水气单胞菌所产的几丁质酶的酶学性质进行研究.其最适pH为7.0左右,最适反应温度为45 ℃左右.在40 ℃以下有良好的热稳定性,12 h仍有50%残余酶活.Mg2 对酶有激活作用,Cu2 和Al3 对酶有明显的抑制作用.该酶对底物的亲和力很大,水解几丁质的Km值为29.15 g/L.     

拮抗性酵母几丁质酶的纯化、性质及抗菌活性

从番茄果实表面分离到一株陆生伊萨酵母（Issatchenkia terricola），它在几丁质诱导下能产生较高活性的几丁质酶。采用硫酸铵盐析、DEAE-纤维素（DE32）离子交换柱层析、SephadexG-100分子筛柱层析，获得了凝胶电泳均一的几丁质酶。用SDS-PAGE测得该酶的相对分子质量为42400；以胶体几丁质为底物的Km和Vmax分别为6．91mg／mL和12．95μmol／min；该酶反应的最适温度和最适pH值分别为50℃和7．0。在50℃条件下，酶蛋白在pH5．0～9．0较为稳定；抗菌活性实验表明，该酶对供试病原菌有不同程度的抑制作用。