栖热袍菌α-葡糖苷酶的基因克隆表达及酶学性质

用分子克隆手段获得栖热袍菌(Thermotoga neapolitana DSM 4359)中的α-葡糖苷酶基因,构建该基因的原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。以Thermotoga neapolitana DSM 4359的α-葡糖苷酶基因DNA为模板,通过PCR扩增目的基因,并连接至表达载体中,构建重组质粒pET-28a-glu,然后转化到大肠杆菌中,加IPTG诱导获得重组蛋白。提取粗酶,用葡萄糖测定试剂盒测酶活。序列分析结果表明,该基因的读码框碱基长度为2166bp,编码722个氨基酸;SDS-PAGE电泳结果表明,α-葡糖苷酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,蛋白分子量约为62KDa;酶的最适反应温度为70℃,最适pH为5.0。     

嗜热果糖苷酶的基因克隆及表达优化

从嗜热菌Thermotoga neapolitana DSM4359得到嗜热果糖苷酶基因片段,以p ET-28a(+)为表达载体,在Escherichia.coil BL21(DE3)中高效表达。由SDS-PAGE检测可得构建后嗜热果糖苷酶的分子量约为60 KDa。通过单因素试验和响应面法对该嗜热果糖苷酶的产酶培养基进行优化选择,最终确定最佳产酶培养基为:蔗糖10.11 g/L,硝酸铵12.30 g/L,安琪酵母浸粉FM905 8.24 g/L,MgSO_4·7H_2O 5.61 mmol/L,NaCl 10 g/L。相比优化前,经优化后的培养基所产嗜热果糖苷酶酶活提高了近2.1倍。达到了提高嗜热果糖苷酶表达量的目的。     

新型中性植酸酶在大肠杆菌中的高效表达、纯化及酶学性质

运用基因工程技术,将克隆到的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061新型中性植酸酶基因(GenBank登录号为HM747163)构建到表达载体pET22b(+)上,并在E.coli BL21(DE3)中进行高效表达。电泳结果表明该酶分子质量约为42kD,目的蛋白占大肠杆菌可溶性蛋白30%左右。利用Ni-NTA琼脂糖凝胶进行亲和纯化,酶学性质研究表明,其最适温度为60℃,最适pH值为7.0,最大酶比活力为15U/mg。60℃时以植酸钠为底物的Km值为0.30mmol/L。     

海栖热袍菌α-葡萄糖苷酶基因aglA的克隆、表达及酶学性质

主要研究了在大肠杆菌中克隆和表达海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的一个α-葡萄糖苷酶(TM1834).通过PCR方法克隆编码T.maritima的一个α-葡萄糖苷酶基因aglA,构建重组质粒pHsh-AglA,电击转化Escherichia coli JM109,通过热激诱导高效表达.SDS-PAGE检测出蛋白相对分子质量约55 000,经热处理,阴离子交换层析和疏水层析纯化后的α-葡萄糖苷酶最适反应温度为90℃,最适反应pH为7.5,在pH 6.5～8.5,温度65～100℃之间酶活仍达到50％以上.在辅助因子NAD+,Mn2+和还原剂DTT的存在条件下达到最高酶活.     

Picrophilus Torridus嗜热酯酶的克隆表达及性质研究

目的目的以Picrophilus torridus DSM9790基因组为模板,克隆嗜热酯酶EstPt 1的基因,实现其在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达,并对重组EstPt 1进行酶学性质表征。方法利用PCR扩增,获得EstPt 1基因,连接到pET-28a(+)质粒,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建重组工程菌株。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),对硝基苯酚法(p NPB),薄层色谱(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)对EstPt 1的性质进行研究。结果 EstPt 1成功表达,分子量为35 kD;最适反应温度为85℃,最适pH 9.0,有良好的热稳定性和酶活,能在24 h内完全降解5 mmol/L邻苯二甲酸二丁酯(DBP)。结论重组EstPt 1有很强的高温耐受性和稳定性,以及良好的DBP降解活性。     

热纤梭菌β-葡聚糖酶基因的克隆和表达

提取热纤梭菌(Clostridium.sp)基因组DNA,首次通过PCR克隆了该菌的β-葡聚糖酶基因全长。结果表明:该基因全长1040bp,ORF为1003bp,编码334个氨基酸,计算分子质量为37.8kD,等电点为7.67。经Blast分析,该序列与热纤梭菌同源性最高(99%),而与基因库中嗜热梭菌的同源性为94%,该基因已被GenBank接受(AY225318)。用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切目的片段和表达载体pET-30a(+)后相连接,构建重组表达载体pET-clo,并导入BL21细菌中表达。酶学特性表明:SDS-PAGE电泳在37kD左右有表达蛋白带,该工程菌最适酶活29.4U/mL,是出发菌的15倍,最适温度80℃,最适pH9。该工程菌可作为耐热性材料构建耐热性好、酶活高的杂合基因工程菌。     

一株嗜热梭菌β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及表达

以嗜热梭菌(Symbiobacterium thermophilum IAM 14863)基因组DNA为模板克隆了编码葡聚糖内切酶的基因,同时将该酶基因构建于表达载体pET32a(+)中,获得重组表达载体pET32a-Glu,转化至E.coli BL21(DE3)PLYS中并进行表达。结果表明:该基因大小为1 101 bp,共编码366个氨基酸;SDS-PAGE电泳结果表明该基因在E.coli BL21(DE3)PLYS中得到了有效表达,相对分子质量约为60 kDa,纯化后重组酶活力为103 U/mL;酶学性质实验结果表明:酶最适pH值为5左右,最适反应温度为55℃,且此酶具有良好的耐热性(75℃左右)和pH值稳定性。     

海洋来源褐藻胶裂解酶及其基因B1SM的克隆和表达

从海洋来源的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.) B1基因组中克隆1个褐藻胶裂解酶基因,并在大肠杆菌中实现异源表达,分离纯化重组酶并研究其酶学性质。通过Touch down PCR与热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)从假交替单胞菌B1基因组中扩增到1个褐藻胶裂解酶基因(B1SM),将目的基因插入到p GEX-4T-1载体,转化到宿主大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli) BL21 (DE3)。结果显示,从菌株B1克隆得到褐藻胶裂解酶基因B1SM,序列长度为1 005 bp,编码334个氨基酸,理论等电点为8. 51,编码蛋白质的理论分子质量为37. 13 k Da。重组褐藻胶裂解酶B1SM的最适pH和温度分别为8. 0和25℃。该褐藻胶裂解酶在pH 7. 0～9. 0范围内,25℃下保温1 h,仍剩余60%以上活力,pH稳定性较好。在最适pH 8. 0和30℃下保温1 h重组酶仍剩余60%以上活力。该研究为褐藻胶裂解酶基因B1SM在E. coli BL21(DE3)中实现了异源表达,为褐藻胶裂解酶的制备和研究奠定基础。     

黏质沙雷菌ECU1010脂肪酶新基因lipB的克隆和表达

目的 克隆黏质沙雷菌ECU1010脂肪酶基因lipB于大肠杆菌中表达后研究其酶学性质.方法 PCR克隆脂肪酶基因,与质粒pET-28a(+)连接后转化至大肠杆菌BL21(DE3).硫酸铵沉淀法纯化表达产物,研究酶的稳定性等酶学性质.结果 成功克隆了S.marcescens ECU1010中脂肪酶基因lipB(GenBank:HM440338),在E.coli中高效表达.LipB最适反应温度40℃,最适pH8.5.该酶能在pH5～7条件下保持稳定,Ca<'2+>有促进酶活性的作用.LipB对不同有机溶剂的耐受性与黏质沙雷菌脂肪酶LipA有明显差异.结论 lipB基因克隆丰富了脂肪酶基因资源,分析LipB的酶学性质表明,此酶在食品工业和手性药物的拆分等领域有广阔的应用前景.     

嗜热厌氧乙醇杆菌组氨酸融合双活性乙醇脱氢酶的克隆、表达和酶学性质

乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶是嗜热厌氧乙醇菌Thermoanaerobacter ethanolicus乙醇代谢途径中的关键酶。根据高同源性的NADP(H)依赖型Ⅱ型乙醇脱氢酶(S-ADH)的序列设计引物,从T.ethanolicusJW200基因组中PCR扩增出编码S-ADH的基因,插入带组氨酸标签的pET-20(b),测序获得基因大小为1 059 bp,并在大肠杆菌JM109(DE3)中表达。表达产物经Ni亲和柱提纯达电泳纯。带组氨酸标签的重组NADP(H)依赖型乙醇脱氢酶具乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶双活性,能将乙酰辅酶A转化成乙醇.带组氨酸标签的重组酶酶学性质为乙醛脱氢酶活性最适值为pH 8.4,最适温度70℃;乙醇脱氢酶活性正、逆反应分别最适pH 8.0,最适T 55℃;最适pH8.9,最适为T 60℃。以乙酰辅酶A(Aceyl-CoA)为底物,该酶的Km为3.32 mmol/L,Vmax为12.5μmol/(min.mg)。T.ethanolicusJW200中双活性S-ADH的首次发现,建立了该菌乙醇代谢途径中从乙酰辅酶A到的乙醇的另一条通路。     

黏质沙雷菌ECU1010脂肪酶新基因lipB的克隆和表达

目的克隆黏质沙雷菌ECU1010脂肪酶基因lipB于大肠杆菌中表达后研究其酶学性质。方法 PCR克隆脂肪酶基因,与质粒pET-28a(+)连接后转化至大肠杆菌BL21(DE3)。硫酸铵沉淀法纯化表达产物,研究酶的稳定性等酶学性质。结果成功克隆了S.marcescens ECU1010中脂肪酶基因lipB(GenBank:HM440338),在E.coli中高效表达。LipB最适反应温度40℃,最适pH 8.5。该酶能在pH 5~7条件下保持稳定,Ca2+有促进酶活性的作用。LipB对不同有机溶剂的耐受性与黏质沙雷菌脂肪酶LipA有明显差异。结论 lipB基因克隆丰富了脂肪酶基因资源,分析LipB的酶学性质表明,此酶在食品工业和手性药物的拆分等领域有广阔的应用前景。     

鞘氨醇单胞菌属菊粉酶基因lev的克隆、表达及酶学性质的研究

基于454高通量测序细菌JB13全基因组,获得一个编码菊粉酶的基因lev,该基因全长为1518bp,编码505个氨基酸组成的多肽,成熟蛋白的理论分子量为55.70ku。将基因lev克隆到表达载体pET28a(+),并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物具有菊粉酶活性,并初步研究了该酶的酶学性质。结果表明:酶作用的最适pH为5.5,最适温度为50℃,该研究为鞘氨醇单胞菌属来源菊粉酶的首次报道。     

食鹿角菜交替假单胞菌芳香基硫酸酯酶的克隆、表达及酶学性质

目的:在大肠杆菌中高效表达食鹿角菜交替假单胞菌芳香基硫酸酯酶基因,并对重组酶的酶学性质进行研究,为开发酶法去除琼脂硫酸酯的技术奠定基础。方法:通过PCR克隆芳香基硫酸酯酶基因,将它克隆至表达载体pET-28a;表达产物用亲和层析纯化,并对重组酶的酶学性质进行研究。结果:从食鹿角菜交替假单胞菌克隆得到芳香基硫酸酯酶基因(987 bp),预测编码328个氨基酸残基。将该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达和纯化,SDS-PAGE分析显示,重组酶的分子质量为35.1 ku。以对硝基苯硫酸钾(p-NPS)为底物,酶的比活力达26.7 U/mg,最适反应温度50℃和最适反应pH 7.0,Km为0.65 mmol/L,Vmax为19.99μmol/(mg·min)。除了SDS,重组酶对其他测试的抑制剂和去垢剂具有一定的抗性。重组芳香基硫酸酯酶和龙须菜粗多糖在40℃反应2 h,酶解产物凝胶强度提高2.1倍,可脱除多糖84.9%的硫酸基团。结论 :重组芳香基硫酸酯酶能有效脱除龙须菜粗多糖的硫酸基团,为开发环保、高效的酶法琼脂生产技术奠定基础。     

樟绒枝霉α-淀粉酶在毕赤酵母中的高效表达及在麦芽糖浆制备中的作用

从嗜热真菌樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea)中克隆α-淀粉酶基因McAmyA,并在毕赤酵母GS115中高效表达,经高密度发酵至168 h时,胞外酶活力达到13 440. 6 U/mL。重组α-淀粉酶McAmyA粗酶液经QSFF强阴离子交换层析纯化得到电泳级纯酶,比酶活力为1 230. 2 U/mg。酶学性质研究表明,重组α-淀粉酶McAmyA的最适pH和最适温度分别是6. 5和65℃。以淀粉液化液为底物,在温度60℃,加酶量120 U/g,水解24 h的条件下,重组α-淀粉酶McAmyA水解液化液,制备得到麦芽糖含量为50. 0%(质量分数)的麦芽糖浆。该真菌α-淀粉酶在毕赤酵母中表达水平高,具有很大的应用潜力。     

酿酒酵母醛酮还原酶的克隆表达和酶学性质研究

从酿酒酵母(Saccharom yces cerevisiae)CICC 1002基因组中克隆获得醛酮还原酶基因,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中实现过量表达.重组醛酮还原酶经Ni-NTA亲和层析分离纯化获得高纯度目的蛋白,并对其进行酶学性质表征.该重组酶经SDS-PAGE检测为单一条带,分子量为38 kDa.该酶的最适pH和最适温度分别为6.0,60℃,且具有良好的稳定性.1 mmol/L金属离子C02+或Ni2+显著提高酶活力.底物特异性分析表明:该重组酶对邻位二酮具有较高活力,其中对酮基泛解酸内酯的比酶活可达20.53 U/mg.     

海洋细菌低温葡萄糖氧化酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

为解决细菌葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)活力较低的问题,提取和纯化了实验室保藏海洋细菌Citrobacters sp. 8-III的基因组DNA,并与现存GOD基因比对获得目的序列,以此序列为模板获得GOD基因。将人工合成并密码子优化的GOD基因亚克隆至载体p ET28a(+),构建重组表达载体p ET28a(+)-GOD并转化到E. coli BL21(DE3)中实现表达。经镍柱亲和层析得到较纯的重组GOD,并对其进行酶学性质研究。实验成功构建了产GOD的E. coli BL21(DE3)/p ET-28a(+)-GOD,目的蛋白约46 k Da。重组GOD酶活为2. 04 U/m L,该酶最适作用温度为25℃;最适作用p H为6. 0; K~+、Ni~(2+)对GOD的活性有明显促进作用;重组GOD添加至饲料中可加快雏鸡生长,且具备一定防腐功效。该研究首次将海洋细菌GOD基因导入大肠杆菌中,开拓GOD外源表达新的宿主。同时重组GOD具备低温酶特性,为其在饲料添加剂和低温领域应用奠定了基础。     

古细菌Pyrococcus furiosus嗜热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达

用PCR方法从嗜热古细菌Pyrococcusfuriosus的基因组DNA中扩增出胞外α 淀粉酶完整结构基因 ,插入表达载体pET2 8a中构建成质粒 pET amy(sig+) ,以质粒pET amy(sig +)为底物扩增出不含信号序列的α 淀粉酶成熟肽基因片断 ,获得质粒 pET amy(sig ) ,将重组质粒分别转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)。在T7启动子和lac操纵子控制下 ,通过IPTG的诱导在重组大肠杆菌细胞内分别表达出含信号肽和不含信号肽的融合蛋白。其中不含信号肽的融合蛋白具有与P .furio sus产生的胞外α 淀粉酶相似的酶学性质 :最适pH为 5 .0 ,最适温度约为 95℃ ,在 1 2 1℃下热处理 1h酶活仍能保持 50 %以上 ;含信号肽序列的基因的表达产物不能测到酶活     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因克隆及在毕赤酵母中分泌表达

为大规模制备β-葡萄糖苷酶,构建重组酵母工程菌,实现β-葡萄糖苷酶的分泌表达。根据已报道黑曲霉(Aspergillus niger)β-葡萄糖苷酶cDNA序列设计一对引物,采用RT-PCR扩增,获得黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl)。构建了pMD-18T-bgl克隆载体,bgl亚克隆到质粒pPIC9K,构建表达载体pPIC9K-bgl。经BglⅡ线性化后电转入Pichia pastoris GS115,经过MD、YPD/G418平板筛选阳性克隆,获得分泌表达重组P.pastoris GS115的工程菌。用终体积分数1%的甲醇对其进行诱导表达,SDS-PAGE和酶活测定结果表明,重组毕赤酵母分泌了1个相对分子质量约90 000的蛋白质,与该酶基因产物的理论值一致。酶催化的最适温度为50℃,最适pH 5.5,其酶活达到38 U/mL,比已报导重组酶产酶水平有较大程度的提高。     

D-来苏糖异构酶的酶学性质研究

为探索D-甘露糖的高效酶法合成途径,作者克隆了来源于Peptococcaceae bacterium 1109的D-来苏糖异构酶基因,将其导入到E. coli BL21(DE3)中进行表达。该酶的最适底物为D-来苏糖,并可以高效催化D-果糖与D-甘露糖之间的差向异构反应。以D-果糖为底物时,重组表达的D-来苏糖异构酶的比酶活可达2.5 U/mg,该酶的最适pH为7.5,最适温度为70℃,Co~(2+)可以显著提高该酶的活力。在最适条件下以500 g/L的果糖为底物,反应8 h达到平衡,平衡转化率达19.17%,生产D-甘露糖95.85 g/L。     

海栖热袍菌磷酸戊糖变位酶基因克隆表达及发酵条件优化

目的从嗜热微生物海栖热袍菌中克隆磷酸戊糖变位酶基因,实现其在大肠杆菌中的表达。方法以海栖热袍菌基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增获得编码磷酸戊糖变位酶蛋白基因(ppm),连接到具有T7强启动子的p ET-32a质粒中,构建重组工程菌E.coli BL 21(DE3){p ET-32a-Tmppm}。通过Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验和Box-Behnken试验方法优化工程菌发酵条件,构建回归方程。结果双酶切鉴定、测序分析和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证实海栖热袍菌磷酸戊糖变位酶基因可在工程菌中表达。最佳发酵条件为诱导种龄0.6,诱导温度22.5℃,诱导时间13 h,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.45 mmol/L,培养基初始p H 7.6,接种量2.25%。结论发酵条件优化后磷酸戊糖变位酶表达量大幅提高。实验结果为该酶的性质研究和应用提供了支撑。