人β-NGF蛋白的原核表达、纯化及其生物活性

目的在大肠杆菌中表达人神经生长因子β(β-NGF)蛋白,并进行纯化及生物活性检测。方法以人外周血基因组DNA为模板,PCR扩增人β-NGF基因片段,克隆并测序后,与表达载体pET-28a(+)连接,构建重组表达质粒pET-28a-β-NGF,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。采用分子筛层析法对表达产物进行纯化,复性后用鸡胚背根神经节培养试验检测其生物活性。结果酶切和测序证实,PCR扩增的人β-NGF基因片段为β-NGF成熟肽编码序列;重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的23.5%,主要以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达90%以上,表达量为4.8mg/L菌液,且可明显促进鸡胚背根神经节神经突起生长。结论已在大肠杆菌中成功表达了人β-NGF蛋白,纯化后的重组蛋白具有良好的生物活性。     

人鼻病毒3C蛋白酶基因的克隆、表达、纯化及活性

目的获得重组3C蛋白酶,开发一种新型的基因工程工具酶。方法通过RT-PCR方法获得人鼻病毒3C蛋白酶基因,克隆入表达载体pBV220,构建非融合表达载体pBV220-3C,转化大肠杆菌BL21(Gold)进行表达。表达产物经变性阳离子交换层析纯化后复性,再经Superdex-75凝胶过滤进一步纯化,获得的3C蛋白酶在4℃条件下,酶切融合蛋白IL-11,进行活性测定。结果3C蛋白酶在大肠杆菌中获得了稳定、高效表达,表达量约占菌体总蛋白的25%,以包涵体形式存在。经过纯化、复性,纯度达90%以上,获得的3C蛋白酶能够有效切割含3C酶切位点的融合蛋白。结论已成功开发了一种新型的基因工程工具酶。     

睫状神经营养因子突变体的克隆、表达、纯化及生物学活性

目的设计具有更高生物学活性的睫状神经营养因子突变体,并对其进行表达、纯化及生物学活性检测。方法以计算机分子模拟系统设计突变体,重叠延伸PCR方法获得突变体的编码区DNA序列,克隆入表达载体pThioHisA,转化E.coliBL21,以IPTG诱导表达。复性纯化后,用鸡胚背根神经节无血清培养法和小鼠减重法进行生物学活性测定。结果目的蛋白以包涵体形式存在,表达量在35%以上,纯化后的纯度达95%以上,能有效地促进鸡胚背根神经节的生长,并能使正常小鼠的体重降低,脂肪指数下降。结论所设计的突变体经表达及纯化后,具有良好的生物学活性,为进一步研究突变体蛋白的促神经生长和减肥作用奠定了基础。     

人纤溶酶原饼环区5蛋白的原核表达体系的建立

目的　构建人纤溶酶原饼环区 5 (hPK 5 )蛋白原核表达载体 ,并进行表达和鉴定 ,为获取大量高纯度、具有生物活性的hPK 5蛋白奠定基础。方法　以纤溶酶原cDNA为模板 ,PCR扩增hPK 5基因 ,经酶切后构建表达载体pBV2 2 0 /hPK 5 ,转入大肠杆菌JM10 9进行温控诱导表达 ,表达产物经纯化、复性后 ,检测其抑制鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM)血管新生的生物学活性。结果　带有pBV2 2 0 /hPK 5的大肠杆菌表达的目的蛋白占菌体总蛋白的34 8% ,其表达蛋白具有His tag抗原活性和野生活性。结论　已成功构建了pBV2 2 0 /hPK 5重组质粒 ,并在大肠杆菌中获得高效表达。     

人TRAIL细胞外段基因在大肠杆菌中的表达及其包涵体的复性

目的　在大肠杆菌中表达人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段 (sTRAIL)基因 ,并研究其包涵体的复性。方法　应用RT- PCR法从正常人外周血单核细胞中获得sTRAIL的编码基因 ,将其克隆到原核表达载体pBV2 2 0 ,于大肠杆菌DH5α中通过温控诱导表达 ;将包涵体进行变性和复性处理后 ,采用离子交换层析纯化表达产物 ,并经Dotblot及MTT试验鉴定。结果　通过温度诱导 ,目的基因主要以包涵体形式高效表达 ,包涵体蛋白经梯度透析法复性可获得具有抗肿瘤活性的重组人sTRAIL。结论　已获得大量纯化重组人sTRAIL ,为开发新型抗肿瘤制剂奠定基础。     

布鲁菌BP26基因的克隆、表达及纯化

目的克隆布鲁氏菌BP26基因,并在大肠杆菌中高效表达及纯化BP26蛋白。方法提取布鲁氏菌基因组DNA,用PCR扩增出BP26基因,并克隆到pMD18-T载体上,测序正确后,再亚克隆至pET-28a(+)载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经组氨酸结合树脂柱纯化,并对纯化后的表达产物进行Western blot鉴定。结果重组质粒pETBP26经Nde I与Sal I酶切后,可见大小分别为5400和700bp的片段,与理论值相符。转化大肠杆菌BL21(DE3)后,37℃诱导4h,经SDS-PAGE分析,高效表达出带有His-tag标签的融合蛋白BP26,纯化后的蛋白纯度达96%,经Western blot分析,目的蛋白具有抗原特异性。结论已成功克隆了BP26基因,且表达并纯化了布鲁氏菌BP26蛋白。     

TRAIL与导向肽融合基因的克隆、表达及其表达产物的生物学活性

目的获得具有生物学活性的与导向肽融合表达的重组TRAIL蛋白,提高TRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用。方法构建TRAIL与导向多肽PEPHC1的融合基因,克隆入质粒pGEM-3zf(-)中进行测序,序列正确后,亚克隆入表达载体pBV220中,转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达。结果42℃诱导4h,融合基因得到了表达,SDS-PAGE表明目的蛋白占菌体总蛋白的15%以上,以包涵体形式存在。经包涵体洗涤、变性、复性,并经离子交换层析柱纯化后可得到融合蛋白PE-TRAIL,经体外试验证明具有生物学活性。结论成功克隆并表达了具有生物学活性的与导向肽融合表达的重组TRAIL蛋白。     

b型流感嗜血杆菌D蛋白的原核表达及纯化

目的克隆b型流感嗜血杆菌(Haemophlilus influenza type b,Hib)D蛋白(hpd)基因,原核表达并纯化重组hpd蛋白,为下一步开发以D蛋白为基础的结合疫苗奠定基础。方法从Hib CMCC株基因组DNA中PCR扩增hpd基因片段,克隆入载体pET-30a(+),构建重组原核表达质粒pET-30a-hpd,转化入感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经6 mol/L尿素变性、DEAE阴离子交换柱纯化、透析复性后,采用Western blot法鉴定其反应原性。结果重组表达质粒pET-30a-hpd经PCR及测序证明构建正确;表达的重组蛋白以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的40%;经一步过柱纯化可得到纯度达95%左右的重组蛋白;纯化的重组蛋白可与Hib免疫小鼠制备的抗血清发生特异性反应。结论已成功克隆了Hib hpd基因,并在大肠杆菌中表达了重组hpd蛋白,为下一步开发以D蛋白为基础的结合疫苗奠定了基础。     

人与鼠源内皮抑制素不同标签重组蛋白的表达纯化及活性分析

根据文献报道和NCBI数据库确定人源内皮抑制素(HE)和鼠源内皮抑制素(ME)DNA序列,以DNA合成法分别获得长度为554 bp的人源内和长度为565 bp的鼠源内皮抑素基因;分别构建携带谷胱甘肽巯基转移酶(GST)表达标签的原核表达质粒pGEX-4T1-HE和携带硫氧还蛋白A(TrxA)表达标签的原核表达质粒pET-32a-ME,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,获得不同表达标签的HE、ME重组蛋白. 最后通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)试验验证重组蛋白的抗血管生成活性. 结果表明,构建了人与鼠源内皮抑制素基因不同标签表达载体,在大肠杆菌中成功诱导表达. 获得具有活性的人与鼠源ES重组蛋白. 纯化复性后的重组蛋白能明显抑制新生血管的生长. GST和TrxA标签对增进重组ES可溶表达没有显著差异,两组标签的重组蛋白都主要存在于包涵体内.     

百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素基因的克隆及原核表达

目的克隆百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素(CyaA,ACT)基因,表达并纯化重组CyaA蛋白。方法从百日咳杆菌CS株的基因组DNA中PCR扩增CyaA编码基因,克隆入载体pET30a,构建重组原核表达质粒pET30a/cyaA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经8mol/L尿素变性、透析复性、DEAE阴离子交换柱纯化后,采用Western blot法鉴定其反应原性。结果重组原核表达质粒pET30a/cyaA经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的20%;纯化的重组蛋白纯度达90%左右,可与全细胞百日咳疫苗和无细胞百日咳疫苗免疫血清结合。结论已成功克隆了百日咳杆菌cyaA基因,并在大肠杆菌中表达了重组CyaA蛋白,为进一步开展CyaA的应用研究奠定了基础。     

内源性血管生成抑制因子Arresten基因原核表达条件的优化

目的 优化内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达条件。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,RT-PCR扩增Arresten基因,构建重组表达质粒pBV220-Arr,分别转化感受态E.coli JM109、DH5α、BL21、BL21(DE3),诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物,筛选出最优表达菌种,并对其菌体培养温度和时间、诱导温度和时间及溶解氧量进行优化。结果重组表达质粒pBV220-Arr经酶切及测序证明构建正确,重组表达质粒在E.coli JM109、DH5α、BL21、BL21(DE3)4种菌中诱导2和4 h,均能表达出Arresten蛋白,诱导表达4 h,E.coli BL21(DE3)目的 蛋白表达量最高,湿菌重也明显大于其他菌种。E.coli BL21(DE3)/pBV220-Arr的最佳表达条件为:在500 ml培养瓶中加入100 ml LB氨苄阳性培养基,菌体于30℃培养4 h后,再42℃诱导表达4 h。结论优化了Arresten基因工程菌的表达条件,为重组Arresten蛋白的大量表达提供了参考。     

抗肿瘤坏死因子-α单链抗体在大肠杆菌中的表达及表达条件的优化

目的构建抗肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)单链抗体(Single chain fragment variable,scFv)的原核高效表达体系,并优化表达条件。方法在引物中添加编码6×His的核苷酸片段,使目的蛋白C-末端带有6×His标签。从质粒pCANTAB 5E-scFv中PCR扩增scFv基因,连接至pBV220载体,连接产物分别转化至E.coli BL21(DE3)和DH5α中,42℃诱导表达,并对诱导时间、培养基pH值和类型进行优化,Western blot分析表达产物的反应原性。结果 PCR扩增出的scFv基因片段长度约770 bp,且序列正确;重组表达质粒pBV220-scFv经酶切鉴定证明构建正确;在E.coli BL21(DE3)中可获得表达,在E.coli DH5α中不表达;表达的重组scFv相对分子质量约为28 000,以包涵体形式存在于胞浆中,表达量约占菌体总蛋白的15%,且可与抗His-Tag抗体发生特异性反应;工程菌的最佳诱导表达条件为:以E.coli BL21(DE3)为宿主菌,在pH 7.4的LB培养基中,42℃诱导5 h。结论将scFv的表达载体更换为pBV220,可提高scFv的表达量,在优化表达条件下,scFv的表达水平进一步提高。     

重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的高密度发酵

目的建立重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)工程菌的高密度发酵工艺。方法采用摇瓶及发酵罐培养工程菌BL21/pBV221-rhBMP-7,观察不同培养基、乙酸浓度、pH值、诱导时间等对工程菌菌体生长及目的蛋白表达的影响。在优化的发酵条件下培养工程菌,当菌体A600值达100时,42℃升温诱导,并对表达产物进行纯化。结果发酵培养基与LB培养基培养的工程菌目的蛋白的表达量无明显差异;乙酸可明显抑制菌体生长及目的蛋白表达;最适于菌体生长和目的蛋白表达的pH值分别为6.8和7.6;最佳诱导时间为3h。以优化的发酵条件培养的工程菌诱导3h后,目的蛋白的表达量可达菌体总蛋白的34.9%,最终菌体A600值可达139.5;经纯化的目的蛋白纯度可达95%以上。结论已初步建立了rhBMP-7工程菌的高密度发酵工艺。     

人肌红蛋白基因的克隆、表达及其抗体制备

目的克隆、表达人肌红蛋白基因,并制备人肌红蛋白多克隆抗体。方法应用RT-PCR方法从人骨骼肌总RNA中扩增肌红蛋白基因(hMb)编码序列,克隆入原核表达载体pRSETc中,并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达。表达产物经亲和层析和凝胶层析纯化。纯化蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,并用Westernblot检测其特异性。结果测序表明RT-PCR所得的肌红蛋白基因hMb序列与GenBank(NM203377)中报道的序列一致。该基因在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化,获得电泳纯的蛋白。重组人肌红蛋白的表达水平达12.8%。每升发酵液中可获得纯化的目的蛋白6.438mg。Western blot分析表明该蛋白为融合有6个His的hMb蛋白。ELISA法测得抗体效价为1∶12800,Western blot证实其具有较好的特异性。结论已成功克隆人肌红蛋白基因,在大肠杆菌中获得了可溶性表达,并制备了抗人肌红蛋白的多克隆抗体。     

重组小鼠白细胞介素-17F/His融合蛋白的原核表达、纯化及生物活性

目的在大肠杆菌(E.coli)中表达并纯化重组小鼠白细胞介素-17F(rmIL-17F),并鉴定其生物活性。方法经RT-PCR扩增mIL-17f基因片段,定向插入原核表达载体pET28a,构建重组表达质粒pET28a/mIL-17f,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni2+-NTA亲和层析纯化rmIL-17F/His融合蛋白,Western blot鉴定其反应原性。以纯化复性的rmIL-17F滴鼻干预小鼠,采用实时荧光定量PCR法检测小鼠肺组织IL-6 mRNA的表达,ELISA法检测小鼠外周血IL-17F、IL-4和IFNγ的水平。结果扩增的mIL-17f基因DNA序列与GenBank中登录的mIL-17f基因序列一致,所构建的重组表达质粒pET28a/mIL-17f构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为19000,主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组蛋白纯度约为95%,具有良好的反应原性,经黏膜给药后,可促进小鼠肺组织中IL-6 mRNA的表达,并提高小鼠血清中IL-4和IFNγ的水平。结论已成功地在大肠杆菌中高效表达并纯化了具有生物学活性的rmIL-17F,为进一步研究IL-17F的功能奠定了基础。     

应用pET系统表达rhIFN-α2b基因的研究

目的 以构建的pET28a为表达载体,探讨人 IFN-α2b基因在pET系统中的表达。方法 合成引物,通过PCR扩增人 IFN-α2b基因并引入点突变,在不改变天然 IFN-α2b氨基酸序列的前提下,使原 IFN-α2b基因4个大肠杆菌稀有密码子改变为偏爱密码子,在起始密码子后,编码前16个氨基酸的碱基序列均成为大肠杆菌的偏爱密码子。将PCR产物次级克隆人pET28a载体,构建重组表达载pET28a-IFN-α2b。筛选正确的重组表达质粒pET28a-IFN-α2b转入感受态表达菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,粗提并检测 IFN-α2b活性。结果 重组质粒pET28a-IFN-α2b在宿主菌 BL21(DE3)中表达出的rhIFN-α2b以可溶性蛋白形式存在于粗提上清液中,与原来 pBV889系统表达的干扰素相比,具有更高的生物学活性。结论 应用pET表达系统可表达出具有更高生物学活性的rhIFN-α2b蛋白。     

胸腺素α1串联体的表达、纯化及生物学活性检测

目的　表达胸腺素α1 (Thymosinalpha1,Tα1 )三串体 ,并进行纯化及生物学活性鉴定。方法　使用大肠杆菌偏爱密码子 ,人工合成Tα1 三串体 (Tα1 ③ )基因 ,在表达载体pET -2 2b(+)中克隆 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,经DEAE SepharoseFF阴离子柱纯化Tα1 ③蛋白 ,采用Westernblot鉴定表达产物 ,MTT法检测其生物学活性。结果　获得了纯化的Tα1 ③蛋白 ,相对分子质量约为 10 0 0 0 ,并具有Tα1 ③的生物学活性。结论　利用基因串联表达小分子多肽是一种可行的方法。