米曲霉GX0011 β-果糖基转移酶的分离纯化

通过热变性、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephadex A-50(柱1)、Octyl-Sepharose CL-4B、Sephacryl S-300、DEAE-Sephadex A-50(柱2)层析等分离纯化步骤对本实验室自行筛选诱变的米曲霉GX0011来源的β-果糖基转移酶进行了分离纯化,并通过SDS-PAGE检测了该酶的纯度和亚基分子量.结果表明电泳一条带,亚基表观分子量为5.1×104,小于多数文献报道的结果.纯化倍数为121.7,比活和活力回收分别为1975 U·mg-1和17%.酶活测定表明该酶只起到转果糖基的作用而无水解活性.     

纳滤法制备高纯度雪莲果低聚果糖及其结构表征

采用纳滤分离技术以雪莲果为原料纯化低聚果糖,通过Box-Behnken中心组合设计（CCD）及响应面分析（RSM）建立预测低聚果糖纯度的二次多项数学模型,优化分离纯化工艺。结果表明：操作压力0.15 MPa,循环流量5.3 mL/min,pH值2.7时,纯化倍数为5,实际低聚果糖纯度为95.1%,达到P级产品标准。通过应用HPLC-MS、IR、¹H NMR及¹³C NMR等对雪莲果低聚果糖组分的纯度、组成、结构进行表征,结果表明：分离纯化得到的雪莲果低聚果糖由蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖组成,纯度为95.1%,平均包含5个果糖单元,主要是由β-呋喃构型的果糖组成。     

1,2,3,5-四-O-苯甲酰基-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖的合成

以D-果糖为原料,经过内酯化反应、酰化、羰基还原、再次酰化4步反应合成1,2,3,5-四-O-苯甲酰基-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(化合物d),总收率为10.60%。采用1HNMR、13CNMR和MS对中间产物和目标产物进行了结构表征。在2-C-甲基-D-核糖酸-1,4-内酯(a)的合成中,结合反应条件确定了最佳原料为D-果糖和氧化钙;通过对还原剂硼氢化钠、四氢化铝锂和红铝的比较,得出红铝为中间体2,3,5-三苯甲酰氧基-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(c)合成的较优还原剂,还原收率可达96.20%;通过单因素考察确定三乙胺作为酰化反应的缚酸剂,酰化收率可达75.84%。     

低聚木糖生产用木聚糖酶的选择性合成

以里氏木霉(Trichoderma reesei)Rut C-30为产酶菌,研究了碳源、碳氮比对木聚糖酶酶系组成的影响.低分子量组分较多的木聚糖有利于促进内切-β-木聚糖酶的合成,酶解产物中低聚木糖的含量较高(80.70%).低碳氮比有利于促进内切-β-木聚糖酶的合成,抑制外切-β-木糖苷酶的合成.以低分子量较多的木聚糖(7g/L)为碳源,降低培养基的碳氮比为4.0,调控培养60h,用该木聚糖酶酶解粗木聚糖,产物中低聚木糖占总糖的86.32%.     

菊芋渣选择性吸附天然菊粉酶催化制备短链低聚果糖

以菊粉加工废弃物（菊芋渣）选择性吸附黑曲霉产的天然菊粉酶提高菊粉酶活力（I）与转化酶活力（S）的比值（即I/S比值）,并将此纯化后的菊粉酶应用于后续的短链低聚果糖（FOSs）的生产,考察了纯化后菊粉酶对FOSs产率的影响。结果显示：选择的较佳吸附条件为：菊芋渣质量浓度为100 g/L,吸附pH值为5.0,吸附温度为4℃。经菊芋渣的选择性吸附,天然菊粉酶酶系中转化酶活力降低80.84%,菊粉酶活力保留67.92%,I/S比值由原来的1.13上升至4.02。经菊芋渣选择性吸附后的天然菊粉酶用于制备短链低聚果糖,可显著提高短链低聚果糖的浓度,酶解条件为：菊粉质量浓度为40 g/L,酶解pH值为5.0,温度为50℃,酶用量为20 U/g （以菊粉质量计）,短链低聚果糖质量浓度达到16.06g/L,是原酶液制备短链低聚果糖的2.55倍;短链低聚果糖得率为40.16%。     

离子液体中果糖脱水制5-羟甲基糠醛

以阳离子相同(1-丁基、3-甲基咪唑、[Bmim] )、阴离子不同(Cl-、Br-、[CF3COO]-、[BF4]-、[H2SO4]-和[H2PO4]-)的6种离子液体为溶剂和催化剂,研究反应时间(15～180 min)、反应温度(80～120℃)和离子液体种类对果糖脱水制5-羟甲基糠醛(5-HMF)过程的影响.结果表明,随着时间延长和温度升高,果糖转化率和5-HNF产率增大,但是长时间和高温会降低反应选择性;L酸性的离子液体比B酸性的有利于催化果糖脱水,Cl-离子的存在可抑制分子间缩聚,提高反应选择性.以[Bmim]Cl离子液体为溶剂和催化剂,在120℃和120min条件下,果糖转化率达94.4%,5-HNF产率为70.8%.     

超高效色谱柱分析测定中草药中低聚果糖的方法研究

采用超高效色谱柱建立高效液相色谱法测定中草药中低聚果糖的方法。通过小颗粒色谱柱的高塔板数分离能力,有效排除中草药基质干扰,并准确定量中草药中低聚果糖的含量。结果表明,建立的测试方法下,低聚果糖中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五塘的标曲线性关系良好,相关系数均在0. 999以上,检出限均为0. 3 g/100 g、回收率在95%～105%之间,相对偏差均小于4%。该测定方法操作简单、高效,适合中草药中低聚果糖含量的检测分析。     

喷雾干燥法制备G型低聚果糖干粉及其干粉性质的研究

β-果糖基转移酶转化蔗糖水溶液生成的G型低聚果糖（以下称G-FOS;FOS纯度50％～60％）中,伴有25％～32％葡萄糖及1％～3％果糖生成。在对G—FOS喷雾干燥过程中葡萄糖和果糖很容易吸湿并结块粘壁,而且G—FOS熔点（约62℃）低,在高温干燥过程中易成熔溶态而难以制得干粉。针对这两个难题,以离心式压力喷雾干燥器进行喷干试验,通过正交设计及分析得到的喷雾干燥控制参数为：料液浓度为30％,进风温度为140℃,出风温度为90℃,进风量为40L／s,可制得74～350μm粉状产品,收率约85％．G—FOS干粉在RH≤45％环境放置3天不结块。同时还对G—FOS干粉流动性、回潮时间等性质进行了初步研究。     

2-C-甲基-α-D-呋喃核糖四苯甲酸酯的合成

以D-果糖为原料,经过内酯化反应、酰化、羰基还原、再次酰化4步反应合成2-C-甲基-α-D-呋喃核糖四苯甲酸酯（化合物 d）,总收率为10.60%。采用1H-NMR、13C-NMR和MS等方法对中间产物和目标产物进行了结构表征。在2-C-甲基-D-核糖酸-1,4-内酯（a）的合成中,结合反应条件确定了最佳原料为D-果糖和氧化钙;通过对还原剂剂硼氢化钠﹑四氢化铝锂和红铝的比较,得出红铝为中间体2,3,5-三苯甲酰氧基-2-C-甲基-βD-呋喃核糖（c）合成的较优还原剂,还原收率可达96.20%;通过单因素考察确定三乙胺作为酰化反应的缚酸剂,酰化收率可达75.84%。     

米曲霉果糖基转移酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯

对来自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的果糖基转移酶催化蔗糖(s)与葡萄糖-6-乙酸酯(g-6-a)生成蔗糖-6-乙酸酯(s-6-a)的反应进行了研究。考察了底物质量比m(g-6-a)∶m(s)、反应温度、反应时间、pH、酶的质量浓度对反应的影响。单因素实验结果表明,最优的催化反应条件为:反应温度50℃、pH=6.2、m(g-6-a)∶m(s)=1∶3、反应时间48 h、酶的质量浓度为4.0 g/L。在该条件下,g-6-a的摩尔转化率可达26.69%。     

果糖和蔗糖转化合成5-羟甲基糠醛的研究

以果糖或蔗糖为原料合成呋喃基衍生物是生物质转化利用的重要过程之一。将己内酰胺和对苯甲磺酸进行中和反应制备了有机盐（即己内酰胺-对甲苯磺酸盐）,并研究该有机盐催化果糖和蔗糖脱水合成5-羟甲基糠醛的反应过程。结果发现,在氮气保护下,当使用10.0mol%己内酰胺对甲苯磺酸盐为催化剂时,果糖和蔗糖脱水生成5-羟甲基糠醛的产率分别可达89%和48%。同时,考察了催化剂用量和反应条件对果糖转化反应的影响,并对反应结果进行了讨论。     

1-乙酰基-3,5-二对氯苯甲酰基-2-脱氧-α,β-D-呋喃核糖苷的合成

1-乙酰基-3,5-二对氯苯甲酰基-2-脱氧-α,-βD-呋喃核糖苷是重要的医药中间体。以2-脱氧-D-核糖为原料,经柱色谱柱分离出α体和β体。优化条件为:从甲基-3,5-二对氯苯甲酰基-2-脱氧-α,-βD-呋喃核糖苷合成1-乙酰基-3,5-二对氯苯甲酰基-2-脱氧-α,-βD-呋喃核糖苷的过程中,n(甲基-3,5-二对氯苯甲酰基-2-脱氧-α,-βD-呋喃核糖苷):n(乙酐)为1∶4.4,反应中浓硫酸加入量为2mL,滴加浓硫酸时溶液温度为-2°C,水解温度为6°C,产率可达84.14%。然后运用1H NMR和熔点测定两种方法对分离出的α体和β体进行了表征。     

H-Y/β双微孔沸石分子筛催化果糖脱水生成5-羟甲基糠醛的研究

研究了以H-Y/β双微孔沸石分子筛为催化剂,果糖脱水转化为5-羟甲基糠醛(HMF)的反应,考察不同催化剂、溶剂、助剂用量、反应温度和反应时间,以确定H-Y/Beta双微孔沸石分子筛催化剂催化果糖脱水转化为HMF的最佳反应条件。研究发现,以1 g果糖为原料,最佳反应条件为:催化剂0.05 g、溶剂二甲基亚砜(DMSO)30 mL、助剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)0.03 g、反应温度160℃、反应时间1.5 h,利用紫外分光光度法测定产物,并计算其产率为64.6%。     

小分子伴侣对淀粉样蛋白β聚集抑制作用研究

淀粉样蛋白β(Aβ)的积累和聚集在阿尔茨海默症的致病机理研究中是非常关键的,因而开发能有效抑制Aβ聚集的新型抑制剂具有重要的意义。来源于大肠杆菌分子伴侣GroEL/GroES系统的小分子伴侣(GroEL顶端结构域191-345位残基)可以通过疏水相互作用与目标蛋白结合,具有生物相容性好等特点,是一种潜在的Aβ聚集抑制剂。通过硫代硫磺素T荧光光谱、透射电镜、凝胶过滤色谱分析和细胞毒性实验详细研究了小分子伴侣与Aβ_(42)的相互作用,并与姜黄素、表没食子儿茶素没食子酸酯和槲皮素等多酚类抑制剂的作用进行比较。结果表明小分子伴侣不仅降低了Aβ_(42)的聚集程度,同时也改变了Aβ_(42)的聚集路径,使得其聚集体分子量和纤维形貌发生了显著变化。相较于对照组,添加小分子伴侣后使得Aβ_(42)溶液原位ThT荧光响应值下降了72%,形成的纤维长度从数百纳米下降到小于50 nm,SH-SY5Y的细胞存活率提升了20%。因此,小分子伴侣能有效阻止Aβ纤维聚集体形成,降低其细胞毒性,具有良好的应用前景。     

氨基-β-环糊精-单壁碳纳米管-二茂铁修饰电极对抗坏血酸的电化学行为研究

合成制备了氨基-β-环糊精(NH2-β-CD),然后通过主客体反应将NH2-β-CD与二茂铁(Fc)形成稳定的包合物,再与单壁碳纳米管(SWCNTs)复合后得到NH2-β-CD/Fc/SWCNTs复合膜修饰电极。通过循环伏安法研究该修饰电极对抗坏血酸(AA)的电催化行为。结果表明,在pH7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,电位范围在-0.2～0.6V内,峰电流的变化值与抗坏血酸的浓度在1×10-5～1×10-3mol/L范围内成良好的线性关系,检出限为3.6×10-7mol/L。当用于模拟样品的测定,加标回收率为98.3%～100.8%,效果良好。     

果糖嗪的合成及抗衰老评价

以D-葡萄糖为原料,通过Amadori重排、异丙叉基保护、Pd/C催化加氢脱苄基和氧化芳构化串联反应、脱异丙叉保护4步反应得到果糖嗪,HPLC纯度达96％.使用NMR、MS、X射线单晶衍射技术对关键中间体异丙叉基果糖嗪的结构进行了表征.使用噻唑蓝(MTT)法测定果糖嗪对人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS细胞)活力的影响,筛选获得最佳培养浓度为1μmol/L,可以上调细胞活力,为对照组的125％.采用细胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色法对果糖嗪的抗衰老活性进行了评价,以1μmol/L果糖嗪连续传代培养衰老早期细胞和衰老中期细胞,其蓝染率比对照组分别降低了14％和19％.实验表明,果糖嗪对衰老早期或中期的2BS细胞都有抗衰老活性.     

响应面法优化雪莲果低聚果糖的脱色工艺

在单因素实验的基础上,通过响应面法优化雪莲果低聚果糖溶液的超声波协同H_2O_2脱色工艺;并采用高效液相色谱法测定脱色液中的低聚果糖含量。结果表明,最佳脱色工艺为:超声波功率120 W,H_2O_2体积分数20%,溶液pH为12,脱色时间46 min。在此条件下,平均脱色率61.0%,低聚果糖保留率54.8%,实际总评归一值0.512,与理论预测值相近;脱色液中蔗果三糖(GF2)~蔗果七糖(GF6)的含量分别为17.596%,14.404%,5.197%,2.162%,1.038%。     

响应面法优化雪莲果低聚果糖的脱色工艺

在单因素实验的基础上,通过响应面法优化雪莲果低聚果糖溶液的超声波协同H_2O_2脱色工艺;并采用高效液相色谱法测定脱色液中的低聚果糖含量。结果表明,最佳脱色工艺为:超声波功率120 W,H_2O_2体积分数20%,溶液pH为12,脱色时间46 min。在此条件下,平均脱色率61.0%,低聚果糖保留率54.8%,实际总评归一值0.512,与理论预测值相近;脱色液中蔗果三糖(GF2)^蔗果七糖(GF6)的含量分别为17.596%,14.404%,5.197%,2.162%,1.038%。     

高温液态水中有机酸对果糖分解反应动力学的影响

研究了压力10MPa下、温度453.15～493.15K范围内高温液态水中有机酸（甲酸、乙酸）对果糖分解反应动力学的影响. 实验结果表明,在有机酸存在下,果糖分解反应速度大大加快.在相同浓度有机酸存在时,甲酸对果糖分解反应的促进作用明显大于乙酸.对不同温度、有机酸和反应停留时间对果糖分解的主要产物——5-羟甲基糠醛(5-HMF)和乙酰丙酸(LA)收率的影响进行了考察. 果糖分解反应主要由果糖分解为中间产物5-HMF和5-HMF进一步分解成LA两步组成,乙酸的加入加快了第一步反应速度,而对第二步反应无明显影响,因而中间产物5-HMF收率可高达83%;甲酸的加入可同时加快果糖分解为中间产物5-HMF和5-HMF进一步分解为LA的速度,因此LA的收率得到了较大的提高.     

高效液相色谱法测定2,4-二苯基-1,5-苯并硫氮杂 -α-(丁二酰亚胺基)-β-内酰胺

建立了测定2,4-二苯基-1,5-苯并硫氮杂 -α-(丁二酰亚胺基)-β-内酰胺高效液相色谱法.该法线性范围在0～0.1mg/mL,回归方程为A=196734675.7c-358432.3,相关系数r=0.9993,相对标准偏差0.38%(c=0.06mg/mL,n=5),检出限为0.06μg/mL.平均回收率在95.7%～103.9%之间.