斑马鱼ILF2基因的电子克隆分析

利用电子克隆方法,成功获得了ILF2基因在斑马鱼中的同源基因,为进一步研究斑马鱼ILF2基因功能奠定了基础.斑马鱼ILF2基因cDNA全长为1560bp,含有一个编码387个氨基酸的完整开放阅读框架.比较斑马鱼ILF2基因和人ILF2基因,显示两者编码氨基酸序列相似性为87%,核苷酸序列有72%相同.     

快生型大豆根瘤菌（Rhizobium fredii）3．7Kb增效片段的亚克

利用柯氏质粒ｐＬＡＦＲ１为载体构建了快生型大豆根瘤菌Ｂ５２菌株的基因文库，并通过植物结瘤试验筛选到一个３．７Ｋｂ增效片段，将其导入慢生型大豆根瘤菌２２１０，能提高其共生固氮效率。所得高效菌株ＨＮ３２在黑龙江、四川和广西大面积应用，平均增产１１．４％（５）。本文测定了３．７Ｋｂ片段的核苷酸序列，计算机分析发现含有两个开放阅读框架（ＯＲＦｓ）。ＯＲＦ１编码含１９０个氨基酸的多肽，与已报道基因和多肽的同源性很低，但其Ｎ端１９个氨基酸与发根农杆菌的乳糖转移酶高度同源。ＯＲＦ２编码含２３５个氨基酸的多肽，与碗豆根瘤菌的ｈｕｐＥ及苜蓿根瘤菌的糖基转移酶基因显示５４％的同源性。     

嗜冷杆菌EastSeaG5-1415脂肪酶基因的克隆和序列测定

从东海深海底泥中筛选到一株产低温碱性脂肪酶的海洋细菌EastSeaG5-1415,经鉴定为嗜冷杆菌Psychrobacter glacincola。将其染色体DNA用Sau3AI部分酶切后,低熔点琼脂糖回收2～10kb的。DNA片段,用Klenow大片段酶半补齐,与用Sal I酶切半补齐的质粒pUC19连接后,转化E．coli．JM109构建基因文库。用平板测活法从基因文库初步筛选到两株产碱性脂肪酶的阳性克隆,采用ELISA反应进一步鉴定。序列测定分析表明,两个重组质粒中都包含长度为951bp的碱性脂肪酶基因的完整开放阅读框架(ORF)和上游基因调控序列。此片段编码有317个氨基酸组成的酶,计算分子量为35000 Dal。通过Southem杂交证实了此片段来自于嗜冷杆菌Psychrobacter glacincola EastSeaG5-1415基因细。     

鸭疫里默氏杆菌Ⅰ型磷酸二酯酶基因的发现及其分子特征分析

以兔抗鸭疫里默氏杆菌（RA）阳性血清对RA血清1型CH-1株表达型DNA文库中已通过蓝白斑筛选的一个阳性克隆进行了原位杂交筛选。经过5次免疫筛选后,阳性斑经过体内删除,噬菌粒经酶切分析和序列测定,得到一段4434bp的插入DNA片段。运用NCBI的BLASTN、BLASTP、ORF Finder、Conserved Domains、EMBL的FASTA等程序对该片段中的一个命名为ORF1689的开放阅读框架进行了全面的生物信息学分析。结果显示ORF1689起始密码子上游存在核糖体结合位点,完整ORF含1689bp,编码562个氨基酸,其编码蛋白的理论分子量为59．5kD,等电点为5．82。0RF1689具有phosphodiest蛋白家族的保守区域,与丙杆菌属的Caulobacter sp．K31、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp．）、Sphingopyxis alaskensis和Novosphingobium aromaticivorans的Ⅰ型磷酸二酯酶基因的氨基酸序列同源性分别为49．283％、38．716％、38．693％和38．313％,表明该基因是一种新的Ⅰ型磷酸二酯酶基因。该研究结果对阐明Ⅰ型磷酸二酯酶的生物学功能和RA的生理特性与致病机理提供了理论基础和实验数据。     

斜带石斑鱼生长催乳素基因全长cDNA的克隆、表达及其免疫荧光分析

我们从斜带石斑鱼垂体的SMART cDNA质粒文库中筛选到生长催乳素基因(so-matolactin,SL)的全长cDNA片段,其编码区为1644bp,编码231个氨基酸,其中N-端的24个氨基酸肽段为信号肽。运用RT-PCR技术考察了其在石斑鱼不同组织中的mRNA的转录水平,结果表明,该基因在垂体中大量转录,在其他组织中几乎检测不到转录本的存在。选取基因开放阅读框的核苷酸序列插入pGEX-KG载体进行原核表达,在大肠杆菌中表达的融合蛋白的分子量约为50kDa,并以表达的产物为抗原免疫家兔制备了多克隆抗体。采用冰冻切片和FITC标记的荧光染色方法将SL基因初步定位于脑垂体中部,沿着神经组织边缘分布。本研究为深入研究石斑鱼的生长激素／催乳激素家族的进化关系及SL基因的功能奠定了基础。     

真鲷转铁蛋白基因的克隆与表达特征分析

采用同源克隆的方法,根据相近物种转铁蛋白(Transferrin,TF)基因的序列设计简并引物,在经感染真鲷的cDNA上进行PCR扩增,获得了真鲷TF的全基因编码序列(GeneBank Accession No．AY335444)。该序列由2444bp核苷酸组成,含31bp5’非编码区和340bp3’非编码区以及2073bp的开放阅读框,可编码691个氨基酸,预测分子量约为74．3kD,等电点为5．63。同源性分析表明,真鲷TF与鱼类TF的相似性很高,约为65％～75％;与哺乳类转铁蛋白和乳铁蛋白的相似性约40％～50％;与脊索动物海鞘和无脊椎动物昆虫也有一定的相似性。进化分析表明,该基因是转铁蛋白而不是乳铁蛋白。真鲷TF与其它动物TF结构相似,是由两叶相似的结构域构成的单一肽链;该基因有一信号肽序列,缺乏糖基化位点,在它的两个结构域上,分别有三个TF家族的标签序列及一个MHC分子标签序列;与哺乳类相比,参与蛋白二硫键形成的半胱氨酸以及铁离子结合位点高度保守。RT-PCR结果显示,真鲷TF在肝脏成组成型表达,但在其它组织中的表达可受病原调控,表现为经病原刺激后转铁蛋白基因的组织分布显著增多。     

牙鲆T细胞抗原受体(TCR)β链同源cDNA的克隆

从牙鲆外周血淋巴细胞cDNA文库中克隆TCRβ1319bp同源cDNA序列并对其基因结构进行生物信息学分析。RT-PCR及其编码区为942bp，编码314个氨基酸，编码区包括V、D、J和C区4个基因片段。TCRVβ片段主要包括从2l—115位氨基酸残基的95个氨基酸序列，Jβ区与哺乳动物的Jβ区高度保守，在位于Vβ和Jβ之间的四区中没有发现8碱基保守序列(GGACAGGG），CDR3β氨基酸序列为GTRILYE。牙鲆TCRCβ片段共有179个氨基酸残基，缺失位于四细胞外区和临近区域的2个5—9氨基酸弹性区域。牙鲆TCRCβ片段的铰链区有6个氨基酸残基，缺少半胱氨酸位点，含Lys^271保守位点。经RT-PCR及检测，在脾、外周血和前肾中都发现TCRβ的表达，肌肉和肝中均未克隆到目的片段。     

优质小麦体细胞杂种中一种新的HMW麦谷蛋白亚基基因cDNA的克隆和测序

研究了在小麦(Triticun acetivum L．)与高冰草(Agropyron elngatum(Host)Neviski)不对称体细胞杂种优质株系Ⅱ-1．3中出现的迁移率与优质小麦高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)一致的1B16亚基,通过Westem blot杂交证明了该亚基与普通小麦的1By16亚基有很强的杂交信号。依据Ⅱ-1-3中类似16亚基N端15个氨基酸序列设计简并引物,通过RT．PCR扩增Ⅱ-1—3 F4中未成熟胚种子总RNA,得到三条特异带(2．3、2．2、2．11kb),对其中分子量最大的一条2．3kb带谱进行了克隆、测序。该序列(p16BL-1,测序编号为473)长2298bp,包括2137bp的编码区和161bp的3’非编码区。同源性分析发现,该片段与普通小麦HMW Glu-IR、Glu1BY9同源性较高。利用RNA二级结构预测软件对该片段、GlulR和GlulBy9进行预测表明,所分离的基因片段为一新的HMW-麦谷蛋白基因。该片段所编码的氨基酸序列中,N端的99个氨基酸和C端的42个氨基酸均为典型的HMW麦谷蛋白保守区。中间重复区中6肽重复22个,9肽重复7个。通过对其蛋白质二级结构的预测发现,在460～470氨基酸附近比GlulR和GlulBy9多一个α螺旋区和一个转角。该片段在Genbank中的编号为AY249141,所翻译的蛋白序列编号为AA074630。本文揭示了体细胞杂交引起小麦基因序列变化及与体细胞杂种小麦优良品质的相关性,为小麦品质育种研究提供了新途径。     

南极嗜冷假单胞菌7197的分离和无机焦磷酸酯酶(PPase)基因ppa的克隆

从南极普利兹湾深海沉积物中筛选到一株耐冷菌株7197.16S rDNA序列分析表明,该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas).从该菌的全基因组DNA中克隆到编码无机焦磷酸酯酶(PPase)的ppa基因完整的开放阅读框(ORF),其全长为531bp.该基因编码一个由176AA残基组成的分子量预计为19631 Da的PPase蛋白质,其氨基酸序列与Psychrobacter sp.273-4的PPase有97%的相似性,与Neisseria meningitidis Z2491的PPase有79%的相似性,与Mannheimia succiniciproducens MBEL55E的PPase有75%的相似性.     

油菜叶绿体定点转化载体的构建及其杀虫性

首先从油菜叶绿体基因组克隆得到包含ｒｐｓ７基因在内的１．０ｋｂＤＮＡ片 包含ｎｄｈＢ基因在内的２．４ｋｂＤＮＡ片段,同时从苏云芽孢杆菌质粒上克隆得到一个全长３．５ｋｂ的ＢＴ杀虫蛋白基因ｃｒｙ１Ａａ。然后以ｒｐｓ７和ｎｄｈＢ基因作为同源重组片段,成功构建了包含Ｂｔ杀虫蛋白和ａａｄＡ抗壮观霉素基因的油菜叶绿体定点转化载体,并对克隆菌体总蛋白进行了生物杀虫试验。结果表明,Ｂｔ杀虫蛋白基因能够得到表达,并     

两段杨树叶绿体DNA片段的克隆及叶绿体定点转化载体的构建

利用PCR方法，从毛白杨（Populus tomentosa C.）叶绿体基因组中克隆了1．7kb和1．6kb的相邻DNA片段，对其进行序列分析表明，扩增片段分别具有1766个和1601个核苷酸，前者包括3′rps12，rps7基因的编码区及其边界序列，后者包含ndhB基因的第一外显子和内含子。本文还构建了杨树这两个片段的限制酶切图谱，并以这两个相邻片段为同源重组片段，分别将绿色荧光蛋白（GFP）基因和苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白（Bt）基因，及其原核表达框插入其间，构建了杨树叶绿体定点转化载体pPZG和pPZB。这两个特异性载体将定位整合到杨树叶绿体基因组中反向重复区的rps7和ndhB基因的间隔区，并高效表达GFP和Bt基因。迄今为止，本文所报道的内容在国内、外尚属首次。     

牙鲆淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因片段真核表达载体的构建、表达与免疫效果评价

用淋巴囊肿病毒LCDV-cn感染牙鲆鳃细胞系FG-9307,提取细胞总RNA,用RTPCR法获得了LCDV-cn主要衣壳蛋白(MCP)0.6kb基因片段.将该LCDV-cn-MCP0.6kb片断克隆入真核表达载体pEGFP-N2,得到重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6.采用脂质体法将重组质粒转染入牙鲆鳃细胞系FEC,并进行瞬时表达.通过荧光显微镜观察和特异性RT-PCR检测,证实重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6kb已成功转染到FEC细胞,并得到了初步表达.将重组质粒肌注入牙鲆体内,检测牙鲆外周血、肠、脾脏、前肾和淋巴细胞的增殖反应、呼吸爆发活性及抗体产生水平.结果表明,构建的核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6可诱导牙鲆特异性体液免疫和细胞免疫,具有明显的免疫保护作用.     

海洋沉积物DNA提取前的简易脱腐方法研究

针对海洋沉积环境样品DNA提取中的腐殖酸去除难题,采取先脱除腐殖酸再提取DNA的策略,进行了海洋沉积物DNA提取前的简易脱腐方法研究.依据腐殖酸的理化性质, 遴选出由Tris-HCl、EDTA、Na4P2O7、NaCl、PVP、Triton X-100及脱脂奶粉组成脱腐缓冲液,有效地脱除了腐殖酸.之后采用温和的溶菌酶-蛋白酶K-SDS直接裂解法,获取了大片段(分子量21kb以上)可进行rpoB 基因PCR扩增的海洋沉积物DNA,为海洋沉积环境分子生态学研究与海洋生物活性物质开发奠定了基础.     

淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白基因片段原核载体的构建及表达

淋巴囊肿病病毒感染牙鲆鳃细胞系FG-9307，提取细胞总RNA，采用RT-PCR法成功获得了淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白0．6kb基因片段。构建其原核表达载体，IPTG诱导表达。结果表明，该融合蛋白分子量约48kD，可与抗LCDV多克隆血清特异反应。为LCDV基因工程疫苗的研制奠定了实验基础。     

鸡痘病毒282E4株基因组末端非必需区的序列测定与分析

将鸡痘病毒（ｆｏｗｌｐｏｘ ｖｉｒｕｓ，ＦＰＶ）２８２Ｅ４株７．３ｋｂ的ＢａｍＨＩ片段经亚克隆后，获得ｐＵＦａ，ｐＫＳＦｂ，ｐＵＦｃ和ｐＵＦｄ四个重组策粒。采用ＡＢＩ ３７７ＤＮＡ测序仪荧光标记法对上述质粒进行了序列测定，并应用ＤＮＡ ｓｉｓ Ｖ７．０同ＧｅｎＢａｎｋ中已知的ＦＰＶ序列和痘苗病毒的Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株的全序列进行同源性比较。     

导入四碳二羧酸转移酶基因对费氏中华根瘤菌共和固氮效率的影响

将来自苜蓿中华根瘤菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）的四碳二羧酸转移酶基因（ｄｃｔＡＢＤ）经ｐＩＪ２９２５克隆到广宿主、稳定性质粒ｐＴＲ１０２上,获得诱导型表达的重组质粒ｐＨＮ２０２。在此基础上再引入来自ｐＤＢ３０所含的发光酶基因（ｌｕｘＡＢ）作分子标记,以ｐＴＲ１０２为基础建成带有ｄｃｔＡＢＤ和ｌｕｘＡＢ的重组质粒ｐＨＮ２０５。＃? ｄｇ ｕｓ ｓｇ ｒｕｖ ｗｇｋ ｌｆｔｑ,ｕ     

小冰麦异附加系TAI-27中附加染色体上 NBS同源序列的扩增

植物对病虫害的抗性主要是由抗病基因（resistance gene,R)决定的。目前已经克隆了20多个R基因,大部分都属于NBS－LRR类,这类基因编码NBS（nucleotide binding site,NBS)和LRR(leucine-rich repeat,LRR)两个比较保守的结构域。植物的NBS有几个保守区,本文根据其中的P－loop和GLPL两个保守区设计了简并引物,通过PCR扩增NBS序列。在PCR扩增中使用的DNA模板是从小冰麦异附加系TAI－27中微分离的附加的单条染色体,这条染色体上携带BYDV（barley yellow dwarf virus,BYDV)抗性基因。PCR扩增产物主要有三条带,200bp,400bp和950bp,将其中的200bp(nbsA)和400bp(nbsB)克隆到pGEM T-vector上并分别测序。3个nbsA克隆的测序结果完全一致;对nbsB的60多个克隆的不同酶切分析,只发现了一个克隆的酶切特性与其他不同。所以说,以单条染色体为模板PCR扩增产物组成比较简单,省去了RFLP作图的许多工作,可以为克隆R基因提供特异性探针。本文的实验设计将染色体微切割和微克隆技术与基因克隆联系在一起,为克隆R基因提供了一条捷径。