增加ccaR基因剂量提高棒状链霉菌克拉维酸产量的研究

CcaR蛋白对棒状链霉茵(S.clavuligerus)中克拉维酸的合成具有正调控作用,由ccaR基因编码.PCR获得包含ccaR完整基因及其上下游一定区域的扩增产物,构建重组质粒pSET152-ccaR并转化大肠杆茵ET12567/pUZ8002后,通过属间接合转移至棒状链霉菌B71-14中.pSET152含有attP位点,可以与链霉菌基因组中的attB住点特异性同源整合,将重组质粒pSET152-ccaR携带的ccaR插入到S.clavuligerusB71-14染色体中的attB位点,实现了在S.clavuligerusB71-14基因组中增加一个拷贝ccaR基因的目的,所得的突变株S.clavuligerusB71-14:ccaR产酸量可达821.92 mg/L,是出发菌株的1.54倍.     

棒状链霉菌中lat基因的突变及其对克拉维酸产量的影响

以棒状链霉菌Streptomyces clavuligerus NRRL3585的染色体为模板扩增得到1条1.77kb的lat基因片段,并将其用于构建重组质粒pKCLES。将pKCLES由E.coli ET12567接合转移至S.clavuligerus中。重组质粒pKCLES与S.clavuligerus染色体中野生型lat基因发生同源交换,从而获得了带有阿泊拉抗性的突变菌株。对S.clavuligerus NRRL3585以及lat突变菌株的基因组进行PCR验证,且测定了这2种菌株的产头酶素C的能力。结果均表明,突变菌株中的lat基因中插入了含有阿泊拉抗性的pKC1139片段而遭到了破坏。另外,以HPLC法测定了这2种菌株在不同培养时间(72h和96h)下的克拉维酸的产量,结果显示,lat突变菌株的克拉维酸产量最高能达到其原始菌株的2.3倍。     

海洋放线菌（Salinispora arenicola）基因转移系统的建立

该实验旨在建立海洋放线菌Salinispora arenicola基因转移系统,以便基因敲除和外源基因表达等遗传操作。以整合型质粒pSET152和pIB139为出发质粒,通过接合转移构建了海洋放线菌Salinispora arenicola的基因转移系统。结果表明,25 μg/mL阿泊拉霉素可有效筛选接合子,大肠杆菌与孢子的比例为8∶1时可获得较多的转化子。经聚合酶链式反应（PCR）验证,质粒成功整合到菌株海洋放线菌S. arenicola基因组中,接合子经多次传代后,导入的质粒pSET152和pIB139仍稳定整合于接合子基因组上。成功构建了海洋放线菌S. arenicola接合转移系统。     

产克拉维酸的棒状链霉菌突变株的选育

以棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus),B71为出发菌株,通过紫外线诱变育种,采用琼脂块法初筛和摇瓶发酵复筛,选育出2株甘油耐受性正向突变株S.clavuligerus B71—14和S.clavuligerus B71-49,在摇瓶条件下,其克拉维酸产量与出发菌株S.davuligerus B71相比,分别提高了90.6%和88.8%,并具有良好的遗传稳定性。     

PCR-Targeting体系构建棒状链霉菌基因突变株

棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)可产生多种β-内酰胺类化合物,其中包括克拉维酸。利用聚合酶链式反应(PCR)-Targeting体系构建棒状链霉菌突变株是获得克拉维酸高产菌株的又一可行方法。采用该体系对棒状链霉菌的lat基因进行了敲除,获得了没有抗性标记的lat基因被敲除的突变株S.clavuligerus lat::scar,其克拉维酸产量是出发菌株的2.8倍。由于最终构建的突变株没有抗性标记,因此可以将该方法应用于突变棒状链霉菌的其他基因,实现用一种抗性标记突变同一菌株不同基因的目的,为链霉菌的基因突变提供了又一种有效的方法。     

重组枯草芽孢杆菌PaE菌株的构建及碳代谢阻遏效应研究

通过基因重组的方法,将枯草芽孢杆菌168的α-淀粉酶基因amyE（除掉启动子）整合在Paxo1质粒上,然后将重组表达质粒Paxo1-amyE导入枯草芽孢杆菌168菌株基因组中的半乳糖苷酶基因lacZ位点。通过转化筛选和重组基因分析,获得含有重组α-淀粉酶基因的工程菌株PaE。经过添加4 种不同的碳源发酵实验检测,在外加2 g/100 mL木糖诱导的情况下,重组菌株的α-淀粉酶产量均有增加。而且重组菌株在一定程度上能够克服葡萄糖等还原性糖引起的碳代谢阻遏现象,提高了α-淀粉酶产量。     

代谢改造酿酒酵母生产葡萄糖二酸

以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为底盘微生物,通过表达来源于拟南芥的肌醇加氧酶基因miox4和来源于丁香假单胞菌的糖醛酸脱氢酶基因udh,在酿酒酵母细胞中构建葡萄糖二酸的生物合成途径。通过将拟南芥miox4基因和丁香假单胞菌udh基因整合到酿酒酵母基因组中的delta位点上,葡萄糖二酸产量高达3. 80 g/L,是目前报道的酿酒酵母细胞中葡萄糖二酸的最高产量。这种方法可以广泛用于酿酒酵母细胞的代谢工程研究。     

生物合成γ-氨基丁酸酿酒酵母谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达

为了提高酵母菌的γ-氨基丁酸产量,本研究以十六烷基三甲基溴化铵法(hexadecyl trimethy ammonium bromide,CTAB)提取的酿酒酵母28基因组DNA为模板,扩增得到序列长度为1 758 bp的GAD1基因,经比对与S.cerevisiae S288c的一致性达到98.58%,并设计引物扩增包括GAD1基因上游启动子及调控序列,下游终止子在内的全长基因序列,长度为3 490 bp。将全长基因序列克隆至高拷贝质粒p UG6,构建重组质粒p28。以菌株28作为出发菌株进行转化,经G418抗性筛选得到转化子,进一步经过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)实验验证,质粒提取及酶切验证,确证得到重组子DL28。经重组质粒p28的特性研究得知,重组质粒p28具有良好的遗传稳定性,无抗性传代培养10次重组质粒不丢失。转化后进行酶活力测定,重组子DL28的谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)酶活力比菌株28提高73.8%。通过以上实验结果得出结论,GAD基因高表达菌株DL28具有更高的G418抗性和GAD酶活性。     

18S rDNA介导的桔青霉核酸酶P1表达载体的构建及表达分析

本研究采用黑曲霉Bdel4菌株为宿主菌,敲除gla A,aam A,An05g02100和An12g06930四个主要的胞外分泌蛋白,为核酸酶P1的表达和分泌提供通路。通过PCR扩增得到黑曲霉Bdel4的r DNA序列,构建了以r DNA序列为整合位点的重组质粒p Rp T-nuc P1-18S和p Rp T-2A-nuc P1-18S,将构建的重组质粒p Rp T-nuc P1-18S和p Rp T-2A-nuc P1-18S转入黑曲霉Bdel4。通过半荧光定量PCR进行转化子初筛,之后测定核酸酶P1的酶活复筛,选出一株高活性菌株用于工业生产。采用SYBR Green实时荧光定量PCR法对含外源目的基因nucP1的总基因组样本重复检测,取平均值作为目的基因拷贝数,探究其与酶活表达水平之间的联系。结果显示含9个nuc P1基因拷贝数的菌株的酶活水平达到88.5 U/mL,较核酸酶P1单拷贝菌株增加了3.86倍,较之前研究中异源表达核酸酶产量提高1.20倍,再增加nuc P1的拷贝数时,酶活水平随着拷贝数的增加而降低。     

适应性进化和改造质粒稳定性促进枯草芽孢杆菌合成N-乙酰神经氨酸

N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,NeuAc)作为营养化学品和药物中间体在保健品和医药领域具有广泛的应用。为了提升重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)合成NeuAc的产量,首先利用NeuAc生物传感器(NeuAc-Biosensor)调控抗生素抗性基因表达,在抗生素存在条件下将细胞生长与NeuAc合成相关联。进而通过增加抗生素浓度进行适应性进化,促进NeuAc合成效率提升。研究结果显示,当利用NeuAc-Biosensor分别调控壮观霉素抗性基因(spc)和红霉素抗性基因(erm)时,高产菌株能够在较高抗生素浓度条件下生长。通过在培养过程中逐步增加抗生素浓度开展适应性进化,结果表明采用壮观霉素和红霉素进行双抗性适应性进化时,进化获得的菌株中假阳性率(产量未提高的菌株比例)为46.7%,显著低于采用壮观霉素或红霉素单一抗生素进化获得的菌株中假阳性率(73.3%和66.7%)。通过适应性进化与发酵验证得到1株NeuAc产量为(3.16±0.19)g/L的菌株,产量比出发菌株提高了31.7%。为进一步解决发酵过程中重组B.subtilis质粒丢失的问题,通过将必需基因folB(编码二氢喋呤醛缩酶,dihydroneopterin aldolase)插入携带NeuAc合成途径关键酶编码基因重组质粒并且敲除基因组中的folB基因,质粒的丢失率由34.1%下降至11.8%。该研究提升了重组B.subtilis合成NeuAc的产量和稳定性,为重组B.subtilis发酵法生产NeuAc奠定了基础。     

原生质体融合法提高棒状链霉菌的克拉维酸产量

采用原生质体融合技术,将克拉维酸生产菌——棒状链霉菌甘油耐受性突变株B71-14和舒巴坦钠耐受性突变株B71-50进行了原生质体融合。以2种抗性为选择标记,筛选融合子。从形态上与2亲本菌株不同的98株融合子中发现了1株融合子F-11,既有甘油抗性又有舒巴坦钠的抗性,其克拉维酸产量为742.71 mg/L,是亲本菌株B71-14(538.20 mg/L)的1.38倍,是亲本菌株B71-50(479.91 mg/L)的1.55倍。     

棒状链霉菌F613-1的诱变及其发酵工艺优化

该实验旨在获得克拉维酸高产菌株,并通过发酵条件优化提高其产量。以棒状链霉菌（Streptomyces clavulans）F613-1为出发菌株,通过紫外和亚硝基胍（NTG）联合诱变及含链霉素固定培养基筛选并在对突变菌株添加发酵前体研究基础上,通过单因素试验和响应面法优化其摇瓶发酵条件。结果表明,成功筛选一株棒状链霉菌衍生菌株,克拉维酸产量较出发菌株提高19.9%;添加1.5%甘油和0.15%谷氨酸可大幅缩短突变株发酵时间;突变株前36 h时25 ℃培养,后37 h时29 ℃培养,发酵pH值为7,克拉维酸产量达5.44 g/L,较出发菌株提高了55.8%。棒状链霉菌高产菌株的摇瓶发酵条件优化效果显著,为进一步提高克拉维酸生产提供依据。     

紫外分光光度法测定发酵液中克拉维酸含量的研究

利用克拉维酸与咪唑的衍生物在312nm下具有特征吸收的原理对其含量进行测定，回收率为99．1％～101．7％，衍生后的克拉维酸稳定性较好，增加了测量的准确性，并与高效液相色谱法进行了比较，实验表明该方法具有准确、简便、快速、操作系统简单等特点，对于成品及半成品两种方法测定结果一致，是一种用于检测发酵液中克拉维酸含量的简便、快捷的方法。     

国内保健食品常用益生菌株的耐药性分析

为了解益生菌保健食品中益生菌的耐药性，采用E-Test方法，对中国益生菌保健品市场上常用的菌株进行耐药检测。所用抗生素为抑制细菌细胞壁、细菌核酸合成和蛋白质合成的13种耐药实验常用抗生素(阿莫西林，可克拉维、万古霉素、复方新诺明、甲氧苄胺嘧啶、庆大霉素、氯霉素、链霉素、四环素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、萘啶酮酸、头孢曲松和头孢噻吩)。结果表明：在检测的12株益生菌中，除动物双歧杆菌FDBb-12耐受2种抗生素外，其余菌株分别耐受3～9种抗生素，属于多重耐药菌。耐药的主要模式为丁胺卡那霉素(12/12)、卡那霉素(12/12)、萘啶酮酸(11/12)、复方新诺明(10/12)、甲氧苄胺嘧啶(9/12)和万古霉素(7/12)。其中，罗伊氏乳杆菌的耐药性最强，对13种抗生素中的9种耐药。建立并加强国内益生菌的安全评价和耐药性监测体系是必要而迫切的。     

Isolation and identification of a novel microorganism producing the immunosuppressant tacrolimus

An extensive screening program has isolated a novel microorganism capable of over-producing tacrolimus, an effective immunosuppressant with a superior potency relative to cyclosporine A. The initial screening step based on anti-fungal activity against Aspergillus niger ATCC 6275, a FK506 sensitive test strain, resulted in the isolation of 127 Actinomycetes from Korean soil samples. Subsequent T-cell proliferation assay demonstrated that among the 127 Actinomycetes isolated, only one strain exhibited immunosuppressive activity. Examination of the general taxonomical characteristics and data from the phylogenetic sequence analysis of the 16S rRNA gene led to identification of the isolate as a strain of Streptomyces clavuligerus. The immunosuppressive activity of this newly isolated strain, S. clavuligerus CKD1119 was confirmed to be identical to that of tacrolimus. Moreover, a 7 l jar fermentor experiment using the isolate yielded a peak titer of 58 mg/l for FK-506 production after 8 d of culture in production medium.     

dhaT基因克隆及其与gldABC基因串联表达载体的构建

以肺炎克雷伯氏菌As1.1736的基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到了目的基因(dhaT)并将该基因克隆至pMD19-T Simple载体。基因的序列分析表明,dhaT基因全长为1164bp,编码387个氨基酸。将含有自身核糖体结合位点的dhaT基因片段插入到pMD19-T Simple/gldABC质粒的gldABC基因下游,形成重组克隆质粒pMD19-T Simple/gldABC-dhaT,并进一步将gldABC与dhaT串联基因亚克隆到表达载体pET28a(+)上。