自然发酵腐乳中芽孢杆菌的分离与鉴定

从自然发酵腐乳中筛选芽孢杆菌并研究其作用。根据菌株产蛋白酶能力大小,对自然发酵腐乳中细菌进行分离纯化获得四株芽孢杆菌,经纯化培养后观察其个体形态和菌落形态,利用Biolog微生物自动鉴定系统和16S r DNA序列分析对其精确鉴定。结果显示四株菌株分别为:一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis B),两株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus B),一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens B)。     

基于NRPS功能基因筛选鉴定盐生海芦笋内生细菌的研究

本研究从盐生海芦笋中分离得到两株具有抑菌活性的内生细菌YK-7、YK-10,利用形态学观察、分子生物学方法与生理生化实验对其进行鉴定,并对其发酵产物进行了预测与验证。结果表明两株菌株分别为解淀粉芽胞杆菌亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.Plantarum)以及阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)。通过PCR扩增非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因,发现菌株YK-7含有NRPS基因片段,经系统发育树分析,预测该菌株可能产生环脂肽类化合物Surfactin,进一步对该菌株发酵产物进行电喷雾质谱(Electrospray mass,ESI-MS)分析证实了预测结果。该研究结果证实了从基因预测化合物的结构类型对于定向筛选有价值的化合物具有重要意义。     

基于NRPSs基因筛选与鉴定海芦笋内生细菌

利用形态学观察和分子生物学相结合的方法分离鉴定海芦笋内生细菌,并筛选含有NRPS基因的菌株(nonribosomal peptide synthetase,NRPS),以期获得能够产生环肽化合物的菌株。研究结果表明,共从海芦笋中分离到6株内生细菌Srtli-F1~Srtli-F6,分别鉴定为绿针假单胞菌橙黄亚种(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)、组氨酸节杆菌(Arthrobacter histidinolovorans)、庆盛芽孢杆菌(Bacillus qingshengii)、类芽孢杆菌羽扇豆根瘤菌(Paenibacillus lupini)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、高山麝病原性阿尔伯蒂埃希氏杆菌(Escherichia albertii),其中菌株Srtli-F5检测到含有NRPS基因,经系统发育树分析,预测该菌株可能产生环肽类化合物,该株菌经过发酵,有机溶剂萃取发酵产物,并用电喷雾质谱ESI-MS(electrospray mass,ESI-MS)分析Srtli-F5能产生环肽化合物——杆菌肽,证实了该预测结果。该研究为定向筛选能够产生环肽类化合物的菌种开拓了新思路。     

葡萄抑菌附生细菌筛选鉴定及其结构表征

以夏黑葡萄为研究对象,利用平板划线法分离纯化培养得到附生细菌,通过提取基因组DNA、PCR扩增16S rDNA、基因序列测序,构建系统发育树,进行聚类分析,结合形态学观察,确定菌种的种属地位。在此基础上,以抑菌活性为指标,筛选具有抑菌活性的附生细菌。将筛选到的目标株菌发酵后,采用溶剂萃取得到发酵粗提物,经过电喷雾(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)对发酵产物进行分析,初步确定发酵产物的结构。共从夏黑葡萄中分离鉴定了9株附生细菌,其中BDG-5和BDD-2具有显著的抗菌活性,分别为副假单胞菌(Pseudomonas paralactis)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),ESI-MS分析表明,P.paralactis发酵产物中含有环脂肽surfactin和iturin C,B.velezensis可产生脂肽surfactin、iturin A和bacillomycin D,它们是抑菌活性的主要物质。     

盐生海芦笋抗菌内生细菌的筛选与鉴定

以抗菌活性为指标,从野生海芦笋中筛选与鉴定具有抗菌活性的内生细菌。采用平板分离与斜面纯化的方法,从海芦笋中分离到13株内生细菌,经过对8株病原菌抗菌活性测试,菌株HLS-7和HLS-8对大肠杆菌(Escherichia coli)、金色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)和白假丝酵母(Candida albicans)均显示了较强的抑制活性,其抑菌圈直径均10 mm;对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella penumoniae)均显示了中等抗菌活性,表现出广谱的抑菌活性。PCR扩增这2株菌的16S r DNA区域,单克隆后测序进行同源性分析,构建系统发育树,结合形态学观察和生理生化实验,将菌株HLS-7和HLS-8分别鉴定庆生芽孢杆菌(Bacillus qingshengii)和甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。通过电喷雾质谱分析这2株菌的发酵产物,结果显示,菌株HLS-7可产生脂肽类化合物Fenycin和Iturin,菌株HLS-8可产生脂肽类化合物Iturin,提示这2株菌的抗菌活性可能源于脂肽化合物。     

沙漠生物结皮高产胞外多糖菌株的筛选与鉴定

采用传统的分离纯化方法从沙漠生物结皮中分离到27株产胞外多糖菌株,并通过苯酚-硫酸法从中复筛,筛选到一株产多糖量为7445.80mg/L的菌株XJ-27。根据菌株的形态学特征、生理生化鉴定方法初步鉴定为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis);通过16S rDNA基因序列分析对该菌株进行了鉴定,PCR扩增得到1452bp的序列,PCR产物序列通过Blast软件在NCBI网站中进行同源性比较,通过MEGA4.0软件绘制系统发育树,结果进一步确认了该菌的地位,XJ-27在细菌系统发育分类学上也归属为苏云金芽孢杆菌。     

广谱拮抗菌株的筛选诱变及抗菌物质分离鉴定

分离和鉴定产生广谱抗菌活性物质的菌株,并对抗菌物质分离鉴定。通过形态学、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定菌株。采用紫外线-硫酸二乙酯化学复合诱变的方法,获得抗菌能力强、遗传稳定的高产菌株。分别用甲醇提取、凝胶过滤色谱（Sephadex G-10）和半制备高效液相色谱分离纯化抗菌物质,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）技术对抗菌物质鉴定。本研究从土壤中分离出67 株芽孢杆菌。其中8 株表现出较强的抗菌作用,菌株XF32表现出显著广谱抑制活性,并鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。菌株XF32对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌7 种病原菌具有抗菌活性,对酿酒酵母、黑曲霉、深绿木霉和尖孢镰刀菌有抗真菌活性。经诱变筛选得到突变菌株XF32-22,对金黄色葡萄球菌的抑菌活性比原始菌株显著提高,分离纯化抗菌物质,得到单一的抗菌成分。MALDI-TOF-MS分析表明抗菌物质为Fengycin系脂肽化合物。采用复合诱变技术,可以有效地提高地衣芽孢杆菌脂肽的产量。成功分离得到对多种病原细菌具有较强抑制作用的Fengycin类脂肽,同时该菌株在拮抗植物病原真菌方面也有明显效果。XF32-22菌株在食品保鲜和农业生物防治方面具有很好的应用前景。     

福建海参内源微生物多样性分析及益生菌抑菌机理初探

为探明福建吊笼养殖海参内源微生物群落结构及抑菌作用机理,采用16S rDNA序列同源性比对手段对分离自海参肠道中的优势菌株进行多样性分析,测定其中益生菌及其代谢产物脂肽类化合物的抑菌能力,并采用薄层色谱(TLC)初步确定其抑菌成分。结果表明,福建吊笼养殖海参肠道中共分离出95株优势菌株,包括31株潜在益生菌、37株潜在致病菌及27株普通肠道菌。微生物群落结构分析发现,高丰度假交替单胞菌属和不动杆菌属以及低丰度芽孢杆菌属是福建海参体表产生病灶的可能原因之一。以其中8株典型致病菌为指示菌,筛选出两株抑菌谱广且抑菌能力较强的益生菌菌株-解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YD1及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YK5,其脂肽类代谢产物的抑菌作用明显,初步确定其中的抑菌成分均为含有亲水性成分的环脂肽类化合物。本研究为开发新型微生态制剂和功能性益生菌提供了重要的理论支持。     

旱生植物内生细菌的分离及耐旱菌株的筛选鉴定

为筛选耐旱内生细菌,并对其进行鉴定,以典型耐旱植物为材料,分离纯化出142株内生细菌。采用液体培养基中添加聚乙二醇6000降低渗透势的方法分析内生细菌的耐旱情况。从中筛选出1株能够耐受质量浓度为60g/100mL聚乙二醇6000的内生细菌PB14。对该菌株进行形态学观察,生理生化和16S rDNA序列鉴定,判定菌株PB14为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。     

55株芽孢杆菌16S rRNA基因序列测定与系统发育学分析

采用16S rRNA基因序列分析法对中国工业微生物菌种保藏管理中心(CCIC)保藏的55株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行复核鉴定。菌株经纯化培养,以改良CTAB法提取总DNA,采用细菌16S rRNA通用引物、TD-PCR方法(touchdown-PCR)进行16S rRNA基因序列扩增,PCR产物纯化后直接进行序列测定,序列经人工校对后用Clustal X进行比对分析,最后用MEGA3.1软件构建系统发育树。系统发育分析结果表明:55株枯草芽孢杆菌中有52株菌种与原鉴定结果一致,有3株菌种与原鉴定结果存在差异,其中2株鉴定结果为巨大芽孢杆菌(B.megaterium),另1株鉴定结果为地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)。     

生物表面活性剂生产菌的筛选及鉴定

从原油污染的士样中筛选得到了一株产生物表面活性剂的菌株RDY7-l,经细菌生理生化试验和16SrDNA基因序列分析初步鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),菌株RDY7-1的主要发酵产物通过离子性检测、糖、氨基酸等组分分析初步定性为脂肽类化合物.     

低糖腌制韭菜根中优势腐败菌的分离与鉴定

以胀袋变质的低糖腌制韭菜根为材料,对贮藏过程中的主要腐败微生物进行分离筛选与鉴定。利用纯培养法共筛选出菌落形态差别较明显的优势细菌菌株4株,经形态学观察、革兰氏染色、生理生化鉴定及16S rRNA序列分析鉴定确定了各菌株的种属。结果发现,腌韭菜根中的主要致腐菌由1株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、1株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、1株解淀粉芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus)和1株莴苣不动杆菌(Acinetobacter lactucae)构成。     

土豆烧牛肉方便菜肴胀袋微生物分离鉴定及产气特性研究

为解决土豆烧牛肉方便菜肴产品的胀袋问题,对胀袋微生物进行分离、纯化、鉴定和产气特性研究。分离、纯化得到7株优势微生物。结合形态学观察、16SrRNA序列分析及基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术鉴定分离微生物,结果显示2株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis), 2株为表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis), 2株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),1株为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。将分离菌株接种到无菌土豆烧牛肉样品中,发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)有明显产气现象,是引起产品胀袋的主要原因。     

酿造环境中细菌的筛选及代谢产物研究

研究酿造环境中细菌组成,并进一步筛选出10株产风味物质明显的细菌,通过菌种形态特征、生理生化鉴定、16s rDNA测序分析,1#菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);2#、5#、6#、8#、9#菌株为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans);3#菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis);4#菌株为多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa);7#、10#菌株为环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)。分析这10株细菌的固态培养代谢产物,能够产生多种芝麻香典型呈味物质。     

微波杀菌处理杏汁中残留微生物鉴定

杏汁经微波杀菌(控制微波温度67℃,杀菌3次),从杀菌后杏汁中分离鉴定出3株细菌和1株酵母菌。经形态学、生理生化试验初步鉴定,并分别采用16S r DNA和ITS序列鉴定分离的细菌和酵母菌株,结果表明:残存的细菌分别为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),残存的酵母菌为毕氏酵母(Pichia),且残留微生物均有耐热、耐微波特性。研究确定了微波处理的残留微生物,为完善杏汁微波杀菌工艺提供理论指导。     

芝麻香型白酒高温大曲制曲过程中产酶细菌的分离与鉴定

本文旨在研究芝麻香型白酒高温大曲制曲过程中的产酶细菌。利用传统筛选方法、16S rRNA和DNA促旋酶A亚基基因(gyr A gene)序列分析鉴定及RAPD分子分型技术研究了本实验室提供的制曲3个过程的细菌资源。结果显示10株具有产淀粉酶、蛋白酶的细菌菌株,确定了其精确的分类地位,其中8株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),2株为枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp. subtilis);并发现其中1株贝莱斯芽孢杆菌能在制曲过程中纵向传递与积累。该研究为揭示大曲功能微生物及其作用、增强白酒风味、提高白酒产量具有一定的意义。     

3株降解玉米赤霉烯酮芽孢杆菌的快速鉴定

为了快速确定筛选的3株降解玉米赤霉烯酮的芽孢杆菌(Bacillus sp. YW、Bacillus sp. CP、Bacillus sp. GJ)的分类地位,利用形态学、生理生化特性、保守持家基因的进化分析及特异性PCR对菌株进行鉴定。3株芽孢杆菌的形态特征及生理生化特性非常相似,均产芽孢;结合16S rDNA序列分析、gyrA基因的系统发育树及特异引物PCR结果显示,菌株YW和CP属于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),菌株GJ属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。本研究表明保守持家基因序列分析及特异性PCR,能够快速、灵敏地对芽孢杆菌近缘物种进行分子鉴定,为功能性微生物菌株的快速筛选鉴定提供参考。     

原桃胶中1株芽孢杆菌的分离鉴定及其主要抗菌物质

从天然原桃胶分离到1 株产抑菌活性物质的芽孢杆菌TJ12。其发酵产物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）有抑菌活性。结合菌落形态、生理生化指标、16S rRNA序列和gyrB序列将TJ12菌株鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。通过硫铵沉淀、有机溶剂萃取、羟丙基葡聚糖凝胶、高效液相色谱分离纯化,得到其主要活性物质。该物质对pH值、温度和3 种蛋白酶（胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶）有较好的稳定性。经电喷雾电离质谱分析,初步鉴定该株地衣芽孢杆菌TJ12的主要抗菌物质为杆菌肽A。     

浓香型大曲中蛋白酶产生细菌的分离鉴定

从浓香型大曲中分离纯化得到5株产蛋白酶细菌,对其进行了生化分析,结合《伯杰细菌鉴定手册》对这5株细菌的鉴定。鉴定结果为：A苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）;B枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）;C蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）;D多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）;E枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。对产酶能力最强的C菌株用Biolog微生物自动分析系统进行鉴定,鉴定结果与生化鉴定结果相符合。     

大曲中产纤溶酶芽孢杆菌的分离与鉴定

从大曲中分离筛选到7株具有产纤溶酶能力的菌株。通过菌落形态特征观察、生理生化实验并结合16S rDNA序列分析及系统发育树分析进行了菌种鉴定。结果显示,这7株菌分别为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、空气芽孢杆菌(Bacillus aerius)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。