3种黄酮类化合物对α-淀粉酶的抑制机制

黄酮类化合物可以通过抑制α-淀粉酶的活性来调节血糖水平,然而,黄酮类化合物对α-淀粉酶的抑制机制和二者构效关系的研究十分有限,特别是B环上的羟基化和C环上的糖基化对黄酮类化合物抑制α-淀粉酶的影响尚不清楚。为探究黄酮类化合物对α-淀粉酶的抑制机制和构效关系,分析了芦丁、槲皮素、山奈酚3种黄酮类化合物对α-淀粉酶的抑制类型、荧光淬灭特性、构象变化、结合力和结合位点。结果表明,山奈酚对α-淀粉酶的抑制能力最强,芦丁最弱。C环C3处的糖基化和B环C3''处的羟基化均削弱了黄酮类化合物对α-淀粉酶的抑制作用。淬灭亲和力被C环C3处的糖基增强,被B环C3''处的羟基削弱。3种黄酮类化合物主要通过氢键和疏水作用与α-淀粉酶自发结合,导致酶的结构和疏水微环境被改变,进而有效抑制α-淀粉酶的活性。研究旨在为富含黄酮类化合物的降血糖食品的开发和应用提供理论参考。     

米根霉α-淀粉酶保守区域组氨酸突变及功能性质

有关真菌α-淀粉酶的研究主要集中在酶的底物催化形式等生化性质方面,该类酶中的大量氨基酸残基组成与酶功能性质之间的关系尚不明确。利用分子对接和同源比对等生物信息学分析方法发现米根霉α-淀粉酶中有3个特殊的组氨酸残基(H120,H200和H286),并利用定点突变的方法构建了系列突变体。性质研究表明,286位氨基酸残基结构与该酶的最适反应温度、最适反应pH、酸耐受性以及麦芽糖生成能力均有关联;突变体H286L的酸耐受性和水解淀粉的麦芽糖生成能力得到显著提高;120位和200位氨基酸残基的变化不改变该酶的最适反应温度和最适反应pH,而两者的组合突变可显著提升该酶的酸耐受性。此外,数据表明该酶的高麦芽糖生成能力与酶对麦芽三糖的亲和力不直接相关。研究结果可为真菌α-淀粉酶高麦芽糖生成能力的原因及其定向进化提供一定理论参考。     

嗜热酸性III型普鲁兰多糖水解酶TK-PUL保守基序中关键氨基酸残基对其催化性质的影响

对嗜热酸性III型普鲁兰水解酶TK-PUL保守基序中非保守氨基酸残基进行定点突变，通过比较TK-PUL与突变体的酶学性质，确定保守基序中关键氨基酸残基对其催化性质的影响。TK-PUL保守基序II中I500W位点变化不影响其最适反应pH值、pH值稳定性、最适反应温度、热稳定性，但使其α-淀粉酶活性和普鲁兰酶活性均明显降低。动力学常数测定结果显示，突变体I500W以麦芽三糖为底物的kcat/Km值基本不变，以异潘糖为底物的kcat/Km值约为TK-PUL的64.78%。结果表明，TK-PUL保守基序II中第500位氨基酸残基Ile对其水解糖苷键的偏好性起到重要作用。TK-PUL中I500W位点变化不影响其α-1,4-糖苷键水解活性，但使其α-1,6-糖苷键水解活性明显降低。本研究有助于深入理解TK-PUL的双功能催化机制，也可为TK-PUL的分子改造提供理论依据和设计思路。     

番茄发酵液对α-淀粉酶活性的抑制作用

以番茄为原料进行自然发酵,研究发酵液对α-淀粉酶的抑制效果。采用3,5-二硝基水杨酸比色法分析发酵液不同稀释倍数、作用时间、pH、温度等对α-淀粉酶抑制作用的影响,Lineweaver-Burk双倒数法确定番茄发酵液对α-淀粉酶活性的抑制类型。结果显示自然发酵后番茄对α-淀粉酶的抑制作用显著提高(P<0.05);并且发酵液的不同稀释倍数、作用时间、温度及pH对α-淀粉酶的抑制作用均有显著影响(P<0.05),其最优作用条件为:抑制剂与淀粉酶在33℃、pH6.8下作用10 min;该抑制属于非竞争可逆型,抑制常数为4.01 mg/mL。本研究可为番茄及其发酵制品的开发利用提供新途径。     

苦荞麦浸提液对胰蛋白酶和淀粉酶抑制作用的研究

以酪蛋白为底物测定胰蛋白酶活性,结果发现高浓度的芦丁和苦荞麦浸提液对胰蛋白酶有明显的抑制作用,表明苦荞麦对胰蛋白酶的抑制作用中,芦丁可能起主要作用。对淀粉酶活性的研究还发现,苦荞麦浸提液对α-淀粉酶和β-淀粉酶都有明显的抑制作用,其中对α-淀粉酶起主要抑制作用的物质可能是芦丁,对β-淀粉酶的抑制作用可能是非芦丁物质所致。     

不同酚羟基数目羟基苯甲酸的复合对壳聚糖膜性能的影响

该研究以天然高分子材料壳聚糖为基体，分别添加水杨酸（Salicylic Acid，SA）、原儿茶酸（Protocatechuic Acid，PA）、龙胆酸（Gentisic Acid，GTA）、没食子酸（Gallic Acid，GA）四种不同酚羟基数目的羟基苯甲酸，采用溶剂浇铸法制备成膜。考察了不同酚羟基数目的羟基苯甲酸与壳聚糖共混后复合膜液的流变学特性，使用热重分析（TG）、红外光谱（FT-IR）以及扫描电镜（SEM）对复合膜的结构性能进行表征，并测定了复合膜的机械性能、阻隔性能、总酚释放量和抗氧化性能。结果表明，羟基苯甲酸中酚羟基数目越多，与壳聚糖之间的交互作用越强，使共混膜液中产生高度紧密的网络结构，有利于形成均匀稳定的复合膜。同时具有三个酚羟基的没食子酸与壳聚糖共混成膜后，其紫外阻隔能力良好、水蒸气透过率为1.5010-9 g/(m•h•Pa)、拉伸强度为23.22 MPa、DPPH自由基清除率为71.85%，综合性能表现最佳。以上研究表明，羟基苯甲酸-壳聚糖复合膜的性能受羟基苯甲酸酚羟基数目的影响，酚羟基数目越多，复合膜的综合性能越好。     

枯草芽孢杆菌糖化型α-淀粉酶的研究(Ⅱ)——酶的性质

糖化型α-淀粉酶等电点为pH5.16,分子量为42,000～45,000,紫外吸收值E_(280)/E_(260)=1.80,由396个氨基酸残基所组成,pH稳定范围5.0—8.5,温度稳定范围40—50℃以下,最适作用pH为5.5,最适作用温度66℃,对可溶性淀粉的米氏常数为0.057,最大反应速度为1.3微克分子/分钟·毫升·单位酶活,钠、钾、钙钡等离子有活化作用,铅、汞、铁离子及巯基试剂有抑制作用。     

白曲霉产中温酸性α-淀粉酶组成成分分析及酶学性质的研究

对高产白曲霉菌株产生中温酸性α-淀粉酶进行了酶学性质研究,试验表明该酶最适作用温度为60℃,最适作用pH为5.0,该酶在pH4.5～7.0范围内酶活较稳定,金属离子对此酶几乎没有激活作用,Hg＋、Fe3＋对酸性α-淀粉酶有明显的抑制作用。酸性α-淀粉酶的Vmax为311.53mg/（u&#183;min）,Km为2.18mg/（u&#183;min）。该酶具有较好的耐热性和耐酸性,能在同一pH条件下进行淀粉的液化和糖化作用,具有较好的应用前景。     

鼠尾草酸对α-淀粉酶的抑制作用

抑制α-淀粉酶的活性可以有效降低餐后血糖浓度升高,故本实验从抑制率、抑制类型、荧光猝灭效应及分子模拟几个方面出发研究鼠尾草酸对α-淀粉酶的抑制作用。结果显示,鼠尾草酸对α-淀粉酶有较为显著的抑制作用,半数抑制浓度为1.12 mg/mL,以可逆的竞争性方式抑制α-淀粉酶的活性。荧光猝灭实验结果表明,鼠尾草酸与α-淀粉酶结合后使α-淀粉酶的荧光特性发生静态猝灭。分子对接结果显示鼠尾草酸与α-淀粉酶作用后没有催化底物生成新的产物,而是形成可逆的酶-抑制剂复合物,引起变构调节,从而扰乱了α-淀粉酶的构象动力学,最终导致酶催化活性降低。     

绿原酸对α-淀粉酶的抑制作用及其分子对接模拟

作为淀粉消化关键的水解酶之一,α-淀粉酶的水解作用使淀粉快速消化,引发餐后血糖水平迅速升高,持续性的餐后血糖升高与高血糖、高血脂等代谢性疾病发生呈正相关。利用天然化合物抑制α-淀粉酶活性对降低这些代谢性疾病的发生率具有重要意义。以绿原酸和α-淀粉酶为研究对象,通过体外模拟消化实验发现,当底物浓度为10mg/mL时,α-淀粉酶的活力为2U/mL;水解时间为20min时,其抑制率为67.3%,IC₅₀为4.2mg/mL,证实了绿原酸对α-淀粉酶活性的抑制作用。基于酶反应动力学,利用Lineweaver-Burk双倒数绘图法分析发现,酶的抑制类型为混合型抑制。利用分子对接技术揭示了绿原酸与α-淀粉酶的分子间作用,预测绿原酸对α-淀粉酶的抑制机制为混合型抑制,与酶反应动力学结果相符。分子对接模拟结果表明:绿原酸既能够与α-淀粉酶催化活性部位的Glu261、Asp328和Tyr193形成氢键,实现与淀粉的竞争性抑制;同时也能够与α-淀粉酶的His327、Ala232氨基酸残基形成氢键,实现与淀粉酶-底物复合物的非竞争性抑制。基于绿原酸对α-淀粉酶的抑制作用,利用绿原酸抑制淀粉酶活性从而降低淀粉消化率,延缓餐后由碳水化合物引起的血糖快速升高,以期为应用绿原酸开发适合Ⅱ型糖尿病患者的功能食品提供理论依据和有益参考。     

对羟基肉桂酸对酪氨酸酶催化反应的抑制机理

本文研究了对羟基肉桂酸(HCA)对酪氨酸酶催化单酚底物L-酪氨酸和催化二酚底物L-多巴的抑制能力,并利用紫外-可见光谱、荧光光谱以及分子对接技术探究了其抑制机理。结果表明对羟基肉桂酸对酪氨酸酶催化单酚底物L-酪氨酸比催化二酚底物L-多巴具有更强的抑制作用,半抑制浓度分别为0.096 mmol/L和0.500 mmol/L;紫外-可见分析发现对羟基肉桂酸能与Cu2+发生螯合,使光谱发生明显红移。进一步通过荧光光谱分析得到,对羟基肉桂酸在酪氨酸酶溶液中并没有出现荧光淬灭反而随着对羟基肉桂酸浓度的增大荧光强度变强,说明对羟基肉桂酸被酪氨酸酶催化氧化成对应的醌类物质。利用分子对接技术揭示了对羟基肉桂酸通过氢键和疏水作用竞争性地占据了单酚和二酚底物的空间位置,并与酪氨酸酶中双核铜离子螯合,从而抑制酪氨酸酶催化L-酪氨酸和L-多巴氧化的活性机理。     

苦荞提取物成分分析及不同极性提取物对α-淀粉酶的抑制作用

采用石油醚、乙酸乙酯与正丁醇萃取获得不同极性的苦荞提取物,采用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱法分析提取物的成分。结果表明苦荞提取物中含有大量的黄酮类物质,主要包括芦丁、槲皮素、异槲皮素及其糖苷等,还含有羟基苯甲酸等酚酸类物质。再以抑制率、抑制类型、荧光猝灭效应实验分析提取物对α-淀粉酶的抑制作用。结果表明,苦荞提取物对α-淀粉酶的抑制作用表现为乙酸乙酯相提取物、正丁醇相提取物与粗提物的结果类似,都有较为显著的抑制作用,而石油醚相提取物则没有明显且规律的抑制效果,可推断出苦荞提取物中各成分共同发挥了对α-淀粉酶活性的抑制作用,且抑制类型为非竞争性抑制。通过荧光猝灭实验得知抑制的机理为苦荞提取物中的成分与α-淀粉酶结合,从而使α-淀粉酶的荧光特性发生静态猝灭。     

单宁酸与胰α-淀粉酶作用特性研究

本文考察了单宁酸对胰α-淀粉酶(PPA)的抑制作用,并通过紫外和荧光光谱法研究了二者的作用特性。研究发现单宁酸可明显抑制胰α-淀粉酶的活性,其作用类型为非竞争性抑制。单宁酸与胰α-淀粉酶的结合能自发进行,作用位点靠近PPA的色氨酸残基区域。二者结合后,可导致PPA在270nm附近的紫外吸收发生明显改变,并产生红移,同时可引起PPA荧光猝灭。     

α-淀粉酶的基因改造与菌种选育研究进展

α-淀粉酶是重要的工业用酶制剂之一,能在高温、低pH范围内稳定发挥作用的α-淀粉酶则具有更加广阔的应用前景。本文主要从基因改造与菌种选育两方面阐述了高温α-淀粉酶、酸性α-淀粉酶以及高温酸性α-淀粉酶的研究与开发进展。     

没食子酸对猪胰α-淀粉酶和蛋白酶的抑制作用

以没食子酸为材料,通过考察酶质量浓度、反应体系中底物和酶及没食子酸添加顺序、不同反应时间、不同没食子酸质量浓度对猪胰α-淀粉酶、蛋白酶的活性影响,研究没食子酸对两种酶的抑制作用。结果表明,在底物质量浓度为1g/100mL、体系添加顺序为酶液与抑制剂没食子酸溶液37℃预温5min后加入底物溶液的条件下,没食子酸抑制猪胰α-淀粉酶活性最优条件为:α-淀粉酶质量浓度0.64mg/mL,反应时间15min,没食子酸对α-淀粉酶的最大抑制率为95.52%;在体系添加顺序为酶液与抑制剂没食子酸溶液40℃预温5min后加入底物溶液的条件下,没食子酸抑制猪胰蛋白酶活性的最优条件为:胰蛋白酶质量浓度0.63mg/mL,反应时间30min,没食子酸对胰蛋白酶的最大抑制率为99.24%。没食子酸对两种酶的抑制效果均随没食子酸质量浓度的增大而增强。     

橡子仁萃取物成分分析及对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制作用

为探索橡子仁萃取物的成分组成及对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制作用,以栓皮栎橡子仁为材料,采用超声波辅助乙醇提取和有机溶剂萃取,制备橡子仁乙酸乙酯、正丁醇、水萃取物,通过紫外吸收光谱、高效液相色谱分析各萃取物的化学成分组成,通过抑制率测定、抑制动力学和荧光猝灭试验分析各萃取物的体外抑酶效果及作用机制。结果表明:三种橡子仁萃取物结构高度相似,主要为单宁类物质;乙酸乙酯萃取物含表儿茶素没食子酸酯、没食子酸、没食子儿茶素没食子酸酯等9种物质;正丁醇萃取物含表儿茶素没食子酸酯、儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯等16种物质;水萃取物含没食子酸、绿原酸等21种物质。三种橡子仁萃取物均可有效抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性,乙酸乙酯、正丁醇、水萃取物对α-淀粉酶的半抑制浓度（IC₅₀）分别为1.047、1.122、4.031 mg/mL,对α-葡萄糖苷酶的IC₅₀值分别为0.014、0.028、0.037 mg/mL。三种萃取物对两种酶的酶抑制类型多为混合型抑制,荧光猝灭类型多是以静态猝灭为主,动态猝灭为辅的混合猝灭。     

利用随机突变探讨影响α-淀粉酶催化活性的氨基酸位点

α-淀粉酶广泛应用于食品、纺织、洗涤剂等轻工行业,在国内外酶制剂市场占有重要地位。而淀粉酶之所以起作用,很重要的原因是重要功能区域———催化区域的存在,而催化区域起作用又取决于催化中心的活性位点,因此,活性位点或周围碱基的改变可能会对α-淀粉酶的活性产生很大的影响。本文应用易错PCR技术对来源于Pyrococcus furiosus的α-淀粉酶进行随机突变,测定突变株的酶活,并进行测序鉴定,选取了其中的8个有效突变株作为研究对象,应用生物信息学的方法对这8个有效突变株进行蛋白质结构的分析,探讨不同位置不同氨基酸的突变对蛋白质分子…     

三华李叶抗氧化活性物质的分离鉴定

对比研究了三华李果肉、果核及叶乙醇提取物的总酚、总黄酮含量及其抗氧化活性。三华李叶提取物总酚、总黄酮含量最高,分别为14.75 g没食子酸当量/100 g提取物和5.45 g儿茶素当量/100 g提取物,且三华李叶具有最强的DPPH自由基清除能力(IC50值为79.75μg/m L)及氧自由基吸收能力(ORAC值为6521.74μmol trolox equiv/g)。采用柱层析法,从三华李叶中分离得到三个黄酮类化合物,通过核磁共振法(NMR)及电喷雾质谱法(ESI-MS),鉴定为山柰酚-3,7-二-O-α-L-鼠李糖苷,山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷以及山柰酚-7-O-α-L-鼠李糖苷,三个化合物均为首次从三华李叶中分离得到。其中,山柰酚-7-O-α-L-鼠李糖苷具有最强的DPPH自由基清除能力(IC50为12.93μg/m L)及氧自由基吸收能力(ORAC,8.83μmol trolox equiv/μmol)。山柰酚-3,7-二-O-α-L-鼠李糖苷是三华李叶中含量最多的化合物。因此,三华李叶可作为有效的抗氧化剂用于保健食品。     

根霉ZM-10脂肪酶的分离纯化和活性部位的化学修饰

根霉ZM-10脂肪酶经过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析、SephardexG100凝胶过滤层析得到电泳纯脂肪酶,分子量约为42 ku,纯化倍数15.3倍,酶活回收率22.2%。采用NBS、EDC、DEPC、CH-T、PMSF、DTNB等6种化学修饰剂对根霉ZM-10脂肪酶进行化学修饰和底物保护实验,研究了其分子中氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系。实验结果表明,酸性氨基酸(天冬氨酸?谷氨酸)残基、组氨酸残基、丝氨酸残基、色氨酸残基为根霉ZM-10脂肪酶活性的必需基团。酶分子中酸性氨基酸(天冬氨酸?谷氨酸)残基、组氨酸残基和丝氨酸残基位于根霉ZM-10脂肪酶的活性中心部位,而色氨酸残基在保持脂肪酶活性中起到重要作用,但其不位于根霉ZM-10脂肪酶的活性中心部位。     

地榆炭化学成分的研究(Ⅰ)

目的研究地榆炭的化学成分。方法采用色谱技术分离纯化,通过理化常数和波谱分析鉴定化合物结构。结果从地榆炭中分离6种化合物,分别为3,3’,4’-O-三甲基逆没食子酸（Ⅰ）,3-O-甲基没食子酸甲酯（Ⅱ）,3β,19α-二羟基-乌索-12-烯-28-酸（Ⅲ）,3β-羟基-乌索-11,13（18）-二烯-28-酸（Ⅳ）,β-谷甾醇（Ⅴ）,胡萝卜苷（VI）。结论化合物Ⅳ系首次从地榆中分离得到。