重组人锰超氧化物歧化酶纯化条件研究

目的 研究重组人锰超氧化物歧化酶(rhMn-SOD)的纯化条件.方法 超声法破碎细胞,用热变性方法沉淀蛋白质;优化DEAE离子交换层析的的分离条件,并用葡聚糖凝胶G100分子筛分离纯化蛋白质.结果 菌体破碎最佳超声功率为300W,超声70个循环,粗酶液热处理最佳温度为75℃,时间10 min;DEAE上样缓冲液最佳pH值为9.0,洗脱液NaC1含量为0.1 mol/L,G100纯化后,rhMn-SOD比活达到4 411.706 U/mg,纯化倍数是粗酶液的5倍.结论 得到了适于分离纯化rhMn-SOD的较简便的工艺.     

两种纯化玉米超氧化物歧化酶方法的比较

本文利用硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤初步分离了玉米SOD,利用DEAE-52离子交换层析和金属螯合亲和层析分别纯化了SOD.其中经离子交换层析后的比活为3 304,纯化倍数为118,回收率为4.8%,基本达到电泳纯.经金属螯合亲和层析纯化后比活为8 597,纯化倍数为307,回收率为29.4%,达到了电泳纯.     

A_2菌产蛋白水解酶的分离纯化

利用A2菌种液态摇瓶发酵产蛋白水解酶,后采用硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-75凝胶过滤层析、DEAE离子交换层析对粗酶液进行分离纯化后,蛋白酶比活力达到521.47U/mL,纯化倍数是粗酶液的3.52倍,回收率为8.71%。通过SDS-PAGE凝胶电泳得到单一条带,并测得其相对分子质量约为30kDa。     

重组人锰超氧化物歧化酶纯化条件研究

目的 研究重组人锰超氧化物歧化酶（rhMn-SOD）的纯化条件。方法 超声法破碎细胞,用热变性方法沉淀蛋白质;优化DEAE离子交换层析的的分离条件,并用葡聚糖凝胶G100分子筛分离纯化蛋白质。结果 菌体破碎最佳超声功率为300W,超声70个循环,粗酶液热处理最佳温度为75℃,时间10 min;DEAE上样缓冲液最佳pH值为9.0,洗脱液NaCl含量为0.1 mol/L,G100纯化后,rhMn-SOD比活达到4 411.706 U/mg,纯化倍数是粗酶液的5倍。结论 得到了适于分离纯化rhMn-SOD的较简便的工艺。     

植物乳杆菌乳酸脱氢酶的抽提与初步纯化

研究了从植物乳杆菌RS2 2中提取胞内乳酸脱氢酶的工艺过程,探讨了超声破碎时菌体质量浓度、处理量及处理时间对破碎效果的影响;对酶的提取工艺研究表明,0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)添加0.10～0.30mol/LNaCl可达到较好的抽提效果;对硫酸铵盐析去杂蛋白质及DEAE离子交换层析工艺进行了初步优化.在优化的工艺条件下,酶的总回收率为40.2%,比酶活提高到原来的18.9倍.     

猪心苹果酸脱氢酶的分离纯化及性质

采用组织破碎,二度硫酸铵盐析,DEAE Sepharose F.F.离子交换层析及Sephadex G-75 Fine凝胶过滤等纯化方法,从猪心中提取得到了苹果酸脱氢酶.提取纯化的苹果酸脱氢酶经SDS-PAGE测定显示为单一条带,相对分子质量为34000.酶活回收率为57.99%,最适pH为8.0,最适温度为50℃.     

枸杞多肽的制备及其抗氧化活性研究

研究了中性蛋白酶和木瓜蛋白酶复合水解制备枸杞活性肽的工艺条件,并采用离子交换层析和凝胶柱层析对酶解产物进行纯化,以制备具有较高抗氧化活力的枸杞多肽.以DPPH·清除率为指标,通过响应面优化得到最佳酶解工艺条件:酶解温度51℃,中性蛋白酶与木瓜蛋白酶质量比1∶2.65,酶解时间4.3 h,p H=7.0.此条件下得到的枸杞多肽对DPPH·清除率为(23.32±0.47)%.分别采用DEAE阴离子交换层析和Sephadex G-25凝胶柱层析对枸杞多肽进行分离,最终获得DPPH·和OH·清除率分别为(72.65±1.84)%和(58.72±1.88)%的A-1组分,该组分的DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力和OH·清除能力均随浓度的增大而提高.     

磷脂酶D的纯化及催化制备磷脂酰丝氨酸研究

采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和凝胶层析对广岛链霉菌SK43.001-11发酵液中的磷脂酶D进行纯化,并对双液相体系中酶法制备磷脂酰丝氨酸的工艺进行研究。结果表明,纯化后,磷脂酶D比酶活提高到49.48 U/mg,是粗酶液的54. 37倍,回收率为32.31%。磷脂酶D双液相催化制备磷脂酰丝氨酸的最佳条件为:有机相为乙醚,pH6.5,反应温度30℃,L-丝氨酸与磷脂酰胆碱质量比15∶1,有机相与水相体积比1∶1,反应时间2.5h。在最佳条件下,磷脂酰丝氨酸生成率达到74.8%。     

猪心肌苹果酸脱氢酶的制备及应用

设计并优化了从猪心中提取高纯度苹果酸脱氢酶的技术路线,采用组织破碎、二度硫酸铵盐析、DEAE Sepharose F.F.离子交换层析、Phenyl Sepharose 6 F.F.疏水层析及Sephadex G-75 Fine凝胶过滤等方法进行分离纯化,苹果酸脱氢酶比酶活达1 212.97 U/mg,纯化倍数达122.64倍,酶活力收率为53.64%.Sephadex G-75 Fine凝胶过滤和SDS-PAGE电泳结果显示纯化的苹果酸脱氢酶相对分子质量约为 69 000 ,含有2个亚基,每个亚基的相对分子质量约为 34 000 .以制备的苹果酸脱氢酶和谷草转氨酶配成双酶反应体系,对葡萄酒中L-苹果酸的含量进行了测定;通过标准样品和葡萄酒样品精密度及回收率(93.2%～104%)实验.     

微生物产弹性蛋白酶制取方法的探讨

目的探讨微生物产弹性蛋白酶的制取方法。方法将产弹性蛋白酶的枯草芽孢杆菌接种到发酵培养基中，摇床发酵培养后，离心收集发酵液，并经过硫酸铵盐析、DEAE—SephadexA-25阴离子交换层析、SephadexG-75凝胶过滤层析等步骤纯化弹性蛋白酶。结果经过上述纯化步骤，弹性蛋白酶纯化倍数达到了33倍，回收率达到12％，酶蛋白比活达到了528U／mg。结论此纯化工艺较为理想，获得了较纯的酶蛋白。     

高纯度诊断用乳酸脱氢酶的制备和酶促反应

设计并优化了植物乳杆茵发酵制备高纯度诊断用乳酸脱氢酶的技术路线．从培育的厌氧型植物乳杆茵中粗提乳酸脱氢酶制备液，经过DEAE Sepharose F．F．离子交换层析、Phenyl Sepharose6 F．F．疏水层析及Sephadex G-25 Fine凝胶过滤等方法进行分离纯化，比酶活达1096．8U／mg，纯度达88％，纯化倍数达到21．4倍，酶活力回收率为53．9％；高效液相色谱和SDS-PAGE电泳结果显示制得乳酸脱氢酶相对分子质量约为80000，含有两个亚基，每个亚基分子量约为39000．     

热带假丝酵母木糖醇脱氢酶的分离纯化

探讨了热带假丝酵母中木糖醇脱氢酶的分离纯化工艺。分步采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶层析以及Hi Trap Blue HP亲和层析等纯化方法,得到电泳纯的木糖醇脱氢酶。经SDS-PAGE和native-PAGE分析表明,木糖醇脱氢酶分子质量约为90ku,由2个分子质量为45ku的亚基组成。最终酶蛋白纯化倍数达到60·8倍,回收率为10·9%。     

裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化

采用不同饱和度的硫酸铵溶液对内切β-1,3-葡聚糖酶粗酶液进行分段盐析,以确定最佳盐析条件,将盐析处理后的酶液经透析浓缩、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析等进一步分离纯化,浓缩纯化后的含酶组分,经过SDS-PAGE电泳分析其纯度并初步确定其分子量。结果显示:经过纯化后的内切β-1,3-葡聚糖酶的比活力由20.90U/mg提高到933.37U/mg,纯化倍数为44.7倍,酶活回收率为11.6%,电泳分析呈单一条带,分子量近似为45ku。     

地衣芽孢杆菌2709 蛋白酶分离纯化研究

对产自地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)2709 的碱性蛋白酶通过乙醇沉淀、盐析、DEAE 阴离子交换层析、凝胶层析4 步纯化,最终获得电泳纯的酶。以去酰胺度及酶比活力为指标,对碱性蛋白酶分离纯化条件进行优化。结果发现：提纯酶的比活力达61069U/mg,纯化倍数为38.7,活性回收率为19.3%,去酰胺度为20.9%。并研究该酶的基本酶学特性,结果发现：该酶最适作用pH 值为10.0,最适反应温度为50℃。40℃保温2h 后该酶保持80% 以上的活力,在pH8～11 之间有较高的pH 值稳定性。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

利用硫酸铵盐析、季氨乙基-琼脂糖凝胶FF（Q-Sepharose FF）离子交换层析、苯基-琼脂糖凝胶6 FF（Phenyl-Sepharose 6 FF）疏水层析和丁基-琼脂糖凝胶HP（Butyl-Sepharose HP）疏水层析对黑曲霉来源β-葡萄糖苷酶进行分离纯化,采用十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定其分子质量,并对其酶学性质进行研究。结果表明,经分离纯化后得到分子质量约为116 kDa的β-葡萄糖苷酶,纯化倍数达到50.39倍,回收率为4.65%,比酶活为103.80 U/mg,该β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为60 ℃,最适反应pH值为5.0,在温度30～50 ℃,pH 2.0～8.0之间具有较好的稳定性。     

甘薯叶过氧化物酶的分离纯化及其部分性质研究

经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析,从甘薯叶中得到过氧化物酶(POD)电泳纯制品。该酶比活力为91923.14U/mg,纯化倍数为255.69,回收率为1.59%。该酶分子量约为35kD,最适pH值为5.6,最适温度为60℃。该酶在20～50℃、pH4～8内稳定。以不同浓度H2O2为底物在pH7.2和25℃下测得该酶Km值为0.291mol/L。低浓度草酸、尿素、Li+、Na+、K+、Mg2+等对该酶有激活作用;SDS、KSCN、抗坏血酸(AsA)、Mn2+等对该酶有抑制作用;甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇对POD均有一定抑制作用,其抑制作用强弱顺序为异丙醇>乙醇>甲醇>乙二醇。实验表明,该酶稳定性较强。     

PARTIAL PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF NEUTRAL TREHALASE FROM COMMERCIAL BAKER'S YEAST, SACCHAROMYCES CEREVISIAE

The neutral trehalase of a commercial baker's yeast (S. cerevisiae) strain has been partially purified using ammonium sidfate fractionation and DEAE‐cellulose column chromatography techniques. Trehalase was precipitated between 35–50% ammonium sulfate saturation and approximately 5–8 fold purification was achieved. The yeast cAMP‐dependent protein kinase was also precipitated in the same fraction and these two proteins were separated by DEAE‐cellulose column chromatography. Trehalase became totally inactive after ion exchange chromatography, “cryptic trehalase” (tre‐c), but was later activated with the addition of partially purified protem kinase together with cAMP and ATP. A 215 fold purification was obtained after DEAE‐ceUulose column chromatography. One mM EDTA caused complete inhibition of the enzyme in crude extract, however the inhibition levels in ammonium sulfate and DEAE‐cellulose fractions were 73.5% and 50%, respectively. Optimal pH range and temperature of the enzyme were determined as pH 6–6.8 and 30C, respectively. The kinetic parameters, K_m and V_max, were estimated as 11.78 mM trehalose and 12.47 μmole glucose/min‐mg protein, respectively.     

Isolation of cyclodextrin glucanotransferase preparations of different purities

Purification of cyclodextrin glucanotransferase (EC 2.4.1.19) from the culture liquid of Bacillus megaterium was carried out by the use of three purification procedures: (a) reverse osmosis and organic solvents precipitation, (b) ultrafiltration and gel-filtration chromatography, and (c) ultrafiltration, adsorption on starch, ion exchange chromatography and gel-filtration chromatography. Best precipitation was achieved by i-propanol - 85.92% of initial enzyme activity was preserved with purification of 1.47-fold. PS-20000 appeared to be the most suitable membrane for ultrafiltration. After 8.3-fold concentration by volume, the enzyme was purified 2.46-fold with a yield of 95.30%. As a result of the two-step purification procedure (ultrafiltration with membrane PS-20000 and gel-filtration chromatography) the enzyme was purified 36.2-fold with 95.45% of enzyme activity [measured in micrograms of cyclodextrins formed in 1 ml in 1 min under the assay conditions(U)] preserved. A highly purified enzyme preparation (purification of 74.56-fold and specific activity of 60.39 U/mg protein) was obtained by the third purification procedure. The purified enzyme preparation showed a single protein band on SDS-PAGE, 10% polyacrylamide gel.     

大麦芽极限糊精酶的分离纯化及酶学特性分析

将大麦芽提取的极限糊精酶粗酶液,利用硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶过滤色谱等分离方法对极限糊精酶进行逐步分离纯化。结果表明：纯化倍数为31.23,回收率为8.81%。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,图谱显示样品具有较高的纯度,分子质量约为97kD。同时研究了纯化前后极限糊精酶在不同作用环境下酶的活性变化,发现纯化后样品在温度45℃和pH 5.5左右具有最大酶活性,与粗酶液中酶活性相比具有明显差异。在体系中添加不同浓度的金属离子,结果发现,Mg2+、Ca2+、Mn2+在浓度较低时,对酶活性具有激活作用,而浓度较高时,则具有抑制作用;整体上,K+对酶活性影响不大;Zn2+、Fe2+对酶活性具有抑制作用。