大鼠血清中抗轮状病毒IgG抗体间接ELISA检测方法的建立及验证

目的建立大鼠血清中抗轮状病毒(rotavirus,RV)IgG抗体的间接ELISA检测方法,并进行验证。方法以兔抗RV多抗血清作为包被抗体,RV作为检测抗原,建立抗RV IgG抗体间接ELISA检测方法。棋盘滴定法优化包被抗体浓度(1∶1000~1∶1024000)和血清浓度(1∶20~1∶2560),直接ELISA法优化生物素标记的羊抗大鼠IgG工作浓度(1∶1000~1∶128000稀释)。采用优化的间接ELISA法检测39份RV抗体阴性大鼠血清样品,样品A450均值加上3倍标准差作为该检测条件的阴阳性判定界值。同时对该方法的专属性、检测限、耐用性进行验证。分别采用建立的方法及荧光灶形成单位(fluorescent focus-forming unit,FFU)方法检测96份临床前安全性评价试验样品,评价二者的符合率。结果建立的间接ELISA法的最适反应条件为:包被抗体稀释倍数为1∶8000,血清稀释倍数为1∶80,生物素标记的羊抗大鼠IgG工作浓度为1∶4000,阴阳性判定界值为0.105。方法检测限为0.031,且具有良好的专属性及耐用性。建立的方法与FFU方法检测结果的符合率达95.8%。结论成功建立了抗RV IgG抗体的间接ELISA检测方法,且方法准确可靠,为临床前安全性评价试验提供了一种简便的血清学诊断方法。     

EV71抗原BA-ELISA检测方法的建立及应用

目的建立EV71抗原生物素-亲和素酶联免疫(BA-ELISA)检测方法,并进行验证及初步应用。方法以抗EV71抗体为包被抗体,利用生物素-亲和素系统建立双抗体夹心ELISA法,并对其灵敏度、特异性、准确性及精密性进行验证。采用该方法检测组织培养及临床样品中EV71抗原的含量。结果所建立的BA-ELISA法在EV71蛋白含量625～156.25ng/ml之间线性关系最佳,R2达0.9976,灵敏度为78.125～156.25ng;与包括CoxA16在内的42种肠道病毒及相关病毒均无交叉反应;检测10份EV71阳性样品和10份阴性样品,结果符合率均为100%;检测EV71原液和高、中浓度样品的变异系数分别为3.09%、6.69%和6.43%;可检出约103～104CCID50的活病毒及手足口病患者的大便悬液和部分咽拭子悬液中的病毒。结论用生物素标记EV71抗体与亲和素系统建立的双抗体夹心ELISA法具有较高的特异性、灵敏度、准确性和精密性,为临床检验及抗原分析提供了参考。     

犬粪便中细粒棘球绦虫抗原双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用

目的建立简便、特异的检测犬粪便中细粒棘球绦虫抗原的双抗体夹心ELISA方法,并进行验证及初步应用。方法以细粒棘球绦虫EdiagA864蛋白为抗原,免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体;利用HRP标记兔抗细粒棘球绦虫EdiagA864多克隆抗体,通过溶解、超声方法处理犬粪便样品;以抗细粒棘球绦虫单克隆抗体2D12作为捕获抗体,HRP标记的兔抗细粒棘球绦虫EdiagA864多克隆抗体为检测抗体,通过棋盘法确定抗体最佳包被浓度、最佳封闭剂、待检粪样最佳稀释比例及酶标抗体最佳浓度。应用建立的双抗体夹心ELISA法对来自长春地区的64份犬粪便样品及来自新疆的8份犬粪便阳性样品进行检测。结果兔抗EdiagA864多克隆抗体的效价为105。建立的双抗体夹心ELISA法的最佳检测条件为:抗体包被浓度为1∶50,封闭剂为1%BSA,粪液稀释度为1∶5,酶标二抗稀释度为1∶800。建立的双抗体夹心ELISA法与犬贾第虫和犬蛔虫阳性样品均无交叉反应;检测不同稀释度的粪便液,当稀释至1∶20时,P/N仍大于2;检测6份阳性样品与4份阴性样品的批间和批内变异系数均小于8。用建立的方法检测8份阳性样品的结果均为阳性,64份待检样品的结果均为阴性。结论建立的双抗夹心ELISA方法特异性较强,敏感性较高,重复性较好,为细粒棘球绦虫流行病学调查及诊断提供了一种更简便、快速、特异的免疫学检测方法。     

猪弓形虫循环抗原双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用

目的建立一种检测猪血清中弓形虫循环抗原(circulating antigen,CAg)的双抗体夹心ELISA法。方法利用抗弓形虫表面抗原3(surface antigen 3,SAG3)的单克隆抗体Anti-A-SAG3-7作为捕获抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗弓形虫SAG3的单克隆抗体Anti-A-SAG3-23作为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA法,并对方法的捕获抗体(1∶400~1∶6 400倍比稀释)、检测抗体(1∶400~1∶12 800倍比稀释)、血清稀释度(1∶10~1∶80倍比稀释)及封闭液的种类(5%脱脂奶粉、10%胎牛血清、5%BSA、1%BSA)进行优化,同时验证该方法的敏感性、特异性及精密性。采用优化后的方法对广东和吉林地区的各94份猪血清样本进行检测。结果双抗体夹心ELISA法的最佳检测条件为:捕获抗体Anti-A-SAG3-7及检测抗体HRP-Anti-A-SAG3-23稀释度均为1∶3 200,封闭液为1%BSA,血清稀释度为1∶80。该方法检测两份猪囊虫阳性血清无交叉反应,灵敏度达1∶640,批内及批间的变异系数(CV)均11%。广东和吉林地区各94份样品的阳性率分别为20.2%(19/94)和11.7%(11/94)。结论该方法具有良好的特异性、敏感性及精密性,可用于猪弓形虫CAg的检测。     

丙型肝炎病毒抗体分片段检测方法的建立

目的建立丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)抗体分片段检测方法。方法以葡聚糖T500为骨架,将亲和素和HRP标记于葡聚糖的不同位置上,再分别与含有生物素标签的HCV的核心抗原、NS3、NS4B、NS5反应(亲和素及HRP与HCV抗原的摩尔比均为1∶10),制备HCV抗原聚合物,同时结合免疫层析技术建立HCV抗体分片段检测方法。采用建立的方法检测100份正常人和100份HCV感染者的血清样本,分析层析膜上不同抗原条带组合出现的比例,计算特异度和灵敏度,根据特异度和灵敏度指标来确定阴阳性的判定标准。分别采用本实验建立的方法及商业化的蛋白芯片法检测196份临床血清样本,计算两种方法的符合率。结果 HCV抗体分片段检测方法检测200份临床标本的灵敏度为100. 0%,特异性为100. 0%,检测结果的判定标准为:2条带显色为阳性,1条带显色为可疑,需进一步确认。该方法与蛋白芯片法对196份临床血清样本的4种抗体片段检测结果符合率均达98. 0%以上。结论本研究成功建立了HCV抗体分片段检测方法,该方法具有良好的灵敏度及特异度,可用于HCV感染的诊断。     

人中性粒细胞载脂蛋白快速定量ELISA检测方法的建立

目的建立人中性粒细胞载脂蛋白(HNL)快速定量ELISA检测方法,并进行验证及初步应用。方法以兔抗人HNL多克隆抗体为包被抗体,HRP标记的HNL单克隆抗体为检测抗体,采用双抗体夹心模式,建立快速、一步定量检测HNL的ELISA方法,并进行验证及初步应用。结果最佳包被抗体工作浓度为1μg/ml,检测抗体的最佳稀释度为1∶1000,标准品浓度在0.1～10μg/L范围内呈良好的线性关系,相关系数r>0.98。经验证,该方法的灵敏度可达0.103μg/L;检测7.2、3.6和0.9μg/L浓度的HNL标准品,试验内变异系数分别为5.6%、6.8%和9.8%,试验间变异系数分别为5.7%、6.9%和10.5%;不同浓度的平均回收率为102.04%;抑制试验表明特异性较强;健全性分析表明,样品稀释倍数对该方法无影响;8d连续检测表明稳定性良好。用建立的方法检测30份健康成人血清的HNL含量为(90.73±30.12)μg/L。结论已建立了HNL快速定量ELISA检测方法,该方法简便、快速、稳定,适合临床常规检测。     

乙型肝炎病毒表面抗原化学发光免疫诊断试剂的研制

目的 研制高敏感度、宽线性,且能定量的HBsAg化学发光免疫诊断试剂。方法 将碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)用改良过碘酸钠法标记抗-HBs单抗、山羊抗-HBs多抗,经亲和层析纯化用于制备固相包被板;国家标准品标定HBsAg校准品,优化反应条件,建立HBsAg双抗体夹心一步法检测试剂。结果 试剂灵敏度adr<0.2ng/ml,adw<0.5ng/ml,ay<0.5ng/ml,23份HBsAg阴性Pannel符合率100％;批内CV3％～4.04％,批间CV9.47％～12.5％;准确率91,9％～110.4％;检测限0.023ng/ml;0.1～200ng/ml范围线性相关系数r=0.999 1;与EIA试剂对比分析相对灵敏度100％,相对特异性99.03％;37℃放置12d稳定性与2～8℃存放无异。结论 该HBsAg化学发光免疫诊断试剂适合于临床诊断应用。     

包被伤寒Vi多糖抗原检测鼠血清中伤寒沙门菌抗体的间接ELISA方法的建立

目的建立检测伤寒沙门菌(Salmonella typhi)抗体的间接ELISA方法,并进行验证。方法对常规间接ELISA方法进行优化,确定抗原最适包被质量浓度及被检血清最佳稀释度、最适包被温度及时间、包被抗原与血清的最适温度和时间、血清与酶标二抗及封闭的最适温度和时间、酶标二抗最适工作质量浓度,并验证该方法的灵敏度、精密性、特异性及耐用性;用伤寒Vi多糖结合物原液和伤寒Vi多糖衍生物经小鼠大腿内侧皮下免疫,分别于免疫后第14、21、28、35天,经眼眶采全血,分离血清,应用建立的间接ELISA方法检测抗体水平,计算抗体几何平均滴度(GMT)。结果确定了间接ELISA方法最适工作条件:伤寒Vi荚膜多糖抗原最适包被质量浓度为5μg/ml,血清最佳稀释倍数为1∶40;最适包被温度及时间为4℃12 h;包被抗原与血清最适反应温度和时间为37℃2 h;血清与酶标二抗最适反应温度和时间为37℃1 h;封闭液最适封闭温度和时间为室温1 h;HRP标记的羊抗鼠IgG最佳反应浓度为1∶8 000。该方法灵敏度为1∶1 600;孔间和板间CV平均值分别为2.8%和5.8%;与其他血清无交叉反应;pH值、包被时间、包被温度及酶结合时间调整前后,同一样品检测的A450值差异无统计学意义(P0.05)。伤寒Vi多糖与蛋白载体偶联后,免疫原性明显增强,且白喉类毒素(diphtheria toxin DT)和重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinantPseudomonasaeruginosaexotoxinA,rEPA)两种不同载体偶联得到的结合物免疫原性无明显差异。结论成功建立了一种检测伤寒沙门菌抗体的间接ELISA方法,该方法具有较强的特异性、灵敏度及精密性。     

人β-hCG化学发光免疫分析方法的建立

目的建立一种检测人血清hCG浓度的双抗体夹心化学发光免疫分析方法。方法采用2种高特异性的抗β-hCG单克隆抗体,以一种包被微孔板制成固相抗体,另一种标记碱性磷酸酶,以金刚烷衍生物为底物,采用双抗体夹心法检测人血清hCG浓度,并与进口试剂进行比较。结果以5μg/ml单克隆抗体包被微孔板,酶结合物以1∶10000稀释,在室温条件下检测,可测范围为5~540mIU/ml,灵敏度为0.143mIU/ml,批内、批间平均变异系数分别为5.28%和7.05%,平均回收率为98.77%,范围为92.3%~108.6%,与TSH、FSH和LH的交叉反应率均小于0.01%。与国外同类试剂有良好的相关性。结论该方法有较高的灵敏度、精密性和准确性。     

检测鹿新孢子虫感染的双抗夹心Dot-ELISA方法的建立及其应用

目的建立检测鹿新孢子虫感染的双抗夹心Dot-ELISA方法,并进行初步应用。方法以双抗夹心ELISA方法的A490值对应Dot-ELISA方法显色结果的方式,建立双抗夹心Dot-ELISA方法检测结果判定标准,确定HRP标记的抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体1H11、包被抗体(抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体1A1)、待测血清的最佳工作浓度,并对该方法的特异性、重复性及灵敏度进行验证。用建立的方法检测79份鹿血清,并与双抗夹心ELISA方法进行比较。结果确定该方法 HRP-H11抗体的最佳稀释度为1∶100,包被抗体最适工作浓度为0.3μg/片,待测血清稀释度为1∶8。自然感染犬新孢子虫的鹿阳性血清的敏感性稀释度为1∶64,与弓形虫阳性血清无交叉反应,敏感性、特异性较强;自然感染新孢子虫的鹿阳性血清3次检测结果重复性较好。该方法检测的76份鹿血清中,阳性12份,阳性率为15.2%,与双抗夹心ELISA方法检测结果一致。结论建立的双抗夹心Dot-ELISA方法可用于检测鹿群感染新孢子虫循环抗原,为新孢子虫病的诊断提供了新的方法。     

O型口蹄疫病毒血清抗体竞争ELISA检测方法的建立及验证

目的建立O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)血清抗体的竞争ELISA检测方法,并进行验证。方法采用O型FMDV病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)作为包被抗原,建立用于检测FMDV血清抗体的竞争ELISA方法。对方法的抗原包被浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0μg/mL)、抗原包被温度及时间(4℃过夜、37℃1 h、37℃1.5 h、37℃2 h、37℃2.5 h、37℃3 h)、血清稀释度(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀释)、HRP-IgG稀释度(1∶10000~1∶20000稀释)、封闭液种类(不封闭、1%BSA封闭、2%BSA封闭、5%脱脂乳封闭)、封闭液作用时间(30、60、90、120 min)、血清与HRP-IgG作用时间(30、60、90、120、150 min)、底物TMB作用时间(10、15、20、25、30 min)进行优化。同时验证方法的交叉反应、特异性及敏感性、精密性。采用建立的方法及O型FMDV抗体液相阻断ELISA检测试剂盒分别检测未知血清背景的138份猪和牛血清,计算两者的符合率。结果方法最适检测条件为:抗原包被浓度0.5μg/mL,抗原包被温度及时间为4℃过夜,血清稀释度为1∶4;HRP-IgG稀释度为1∶18000;封闭液为1%BSA,封闭液作用时间为30 min;HRP-IgG与血清作用时间为30 min;底物作用时间为10 min。21份不同猪病的阳性血清中,除3份O型FMD阳性血清为阳性外,其他血清样品为阴性,该方法无交叉反应;敏感性为90.4%,特异性为95.7%;批内和批间精密性试验变异系数(CV)均<10%。该方法与口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测结果的符合率为97%。结论建立的方法具有良好的特异性及精密性,且操作简便,可用于O型FMDV血清抗体的检测。     

狂犬病病毒抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用

目的建立狂犬病病毒(Rabies virμs,RV)抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法,以应用于疫苗生产过程中RV含量的监测。方法将RV aGV株纯化抗原经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,制备抗RV单克隆抗体,纯化后以HRP进行标记,建立双抗体夹心ELISA检测方法。以狂犬病疫苗(效力检定用)国家标准品为定量标准,建立剂量-反应曲线,确定该方法的灵敏度,并对该方法的专属性、精密性及适用性进行验证。结果制备了2株针对不同抗原位点的单克隆抗体1E9和2H1,间接ELISA法测定腹水效价为1∶105～1∶107,纯化后蛋白含量分别为10.285和7.64 mg/ml。建立的ELISA法对RV抗原的最低检出限为1.03 mIU/ml,标准曲线的最佳线性范围为1.03～66 mIU/ml,相关系数为0.991 9。该方法对检测过程中可能遇到的杂质和添加物(人血清白蛋白、牛血清、Vero细胞培养上清)的检测结果均为阴性;检测3个浓度(20、12.50和3.13 mIU/ml)狂犬病疫苗(效力检定用)国家标准品的试验内和试验间变异系数的平均值分别为7.78%和14.0%;用该方法检测不同毒株、不同细胞生产的狂犬病疫苗的RV抗原含量的平均值在0.67～4.86 IU/ml之间。结论成功建立了RV抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法,可对来自不同毒株、不同细胞的狂犬病疫苗的RV抗原进行快速定量检测,为疫苗生产中的质量控制提供了简便的监测手段。     

酿酒酵母残留蛋白ELISA定量检测方法的建立

目的建立酿酒酵母残留蛋白(Host cell protein,HCP)ELISA定量检测方法,为重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)及相关生物制品的质量控制提供依据。方法制备酿酒酵母全细胞蛋白参考品,以其为抗原,免疫家兔,采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体,SDS-PAGE分析纯度,免疫双向扩散法测定抗体效价,Western blot法分析抗体的特异性。以制备的抗酿酒酵母多克隆抗体作为包被抗体,HRP标记的抗酿酒酵母多克隆抗体作为检测抗体,建立酿酒酵母抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法;梯度稀释酿酒酵母蛋白抗原参考品,并绘制标准曲线,确定该方法的线性范围及检测限,并进行特异性、准确度、精密度及适用性验证。结果共制备3批酿酒酵母抗原蛋白,其平均含量分别为1.61、1.64和1.63 mg/ml;纯化的IgG抗体纯度为91.7%,抗体效价为1∶64,能与酿酒酵母蛋白多数条带结合;酿酒酵母蛋白抗原浓度在6.25～200 ng/ml的范围内,线性关系良好(R2>0.99),最低检测限为6.25 ng/ml;用建立的方法检测小牛血清、人血白蛋白、MEM培养基、Vero细胞上清蛋白、Vero细胞乙型脑炎疫苗及PHK细胞狂犬疫苗,均无交叉反应,特异性良好;检测不同浓度的抗原回收率为97.6%～107.00%,变异系数均<10%,最低定量检测限为25 ng/ml;检测3批酿酒酵母重组乙型肝炎疫苗生产各工序中酿酒酵母蛋白的残留量,能有效反映杂蛋白去除率。结论成功建立了酿酒酵母HCP双抗体夹心ELISA定量检测方法,该方法特异性强,精密度及准确度良好,可用于生物制品中酿酒酵母HCP的检测。     

狂犬病病毒抗原定量检测方法的建立

目的建立狂犬病病毒抗原的定量检测方法,用于疫苗生产过程中病毒含量的监测。方法用狂犬病病毒aG株免疫豚鼠,制备抗狂犬病病毒多克隆抗体,纯化后以辣根过氧化物酶进行标记。采用双抗体夹心ELISA法建立检测系统。以狂犬病疫苗国家参考品为定量标准,建立剂量反应曲线,确定该方法的灵敏度,并对该方法的精密性、特异性和适用性进行验证。结果制备的多克隆抗体高峰效价为1∶105,纯化后的抗血清蛋白含量为6.45mg/ml。建立的ELISA方法对狂犬病病毒抗原的最低检出量为5.3mIU/ml,最佳定量区间为10～110mIU/ml,相关系数为0.9983,精密性和特异性较好。用该方法对狂犬病疫苗进行抗原定量,与NIH法测定的疫苗效力具有一定的相关性;检测市售的不同毒株和细胞系生产的狂犬病疫苗,其结果在2.4～9.9IU/ml之间。结论已建立了狂犬病病毒抗原的定量检测方法,可对来自不同毒株和不同细胞系的狂犬病疫苗进行快速定量检测,为疫苗生产中的质量控制提供了简便的监测手段。     

狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法的建立及初步应用

目的建立狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法,用于不同株狂犬病疫苗免疫后抗体水平的检测。方法用市售的不同狂犬病疫苗株抗原免疫NIH小鼠,制备免疫血清,用不同的疫苗株抗原包被酶标板,分别测定小鼠血清抗体效价,并通过不同株抗原抗体的交叉中和实验,分析抗原的差异性;在此基础上,将不同毒株抗原按不同比例混合包被酶标板,分别测定阳性血清样本,并与快速免疫荧光抑制试验(RFFIT)检测结果比较,确定包被抗原模式,建立狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法,绘制标准曲线,确定最佳定量范围及灵敏度,确定Cut-off值;并对其特异性、精密性、准确性及稳定性进行验证;用建立的方法与其他市售狂犬病病毒抗体检测试剂分别检测血清样品,分析检测结果的一致性及相关性。结果狂犬病病毒抗原AG∶CTN-1=4∶1为最适包被抗原模式,试剂经优化后,检测抗体效价范围在535.00～33.44 mIU/ml之间,具有良好的线性关系(r>0.99),最低检出限为8.36 mIU/ml,Cut-off值为0.735 mIU。该方法检测人血清白蛋白、破伤风阳性血清、乙肝表面抗原阳性血清、白喉阳性质控血清均未发生反应;试验内变异系数在6.68%～7.84%之间;回收率在97.25%～104.50%之间;试剂置37℃3 d,与4℃保存试剂测定结果差异无统计学意义(P>0.05)。该方法检测血清样品与市售狂犬病病毒抗体检测试剂比较,均具有良好的一致性;与RFFIT测定结果比较,二者差异无统计学意义(P>0.05),回归方程为Y=-0.475+3.246 X,相关系数为0.801。结论已建立了狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法,可用于大规模狂犬病病毒抗体的筛查。     

b型流感嗜血杆菌多糖ELISA检测方法的建立

目的建立b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)多糖(Polyribosylribitolphosphate,PRP)的ELISA检测方法。方法用灭活的Hib菌免疫家兔,1周免疫4次,共免疫6周,采血,检测血清抗体滴度。对兔免疫血清进行非特异性抗体免疫吸附,纯化兔抗PRP抗体,用纯化的兔抗PRP抗体包被酶标板,HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗,建立双抗体夹心ELISA法检测PRP。确定标准曲线的最佳线性范围,并对方法进行特异性、准确性和精密性验证。结果兔免疫血清的抗体效价可达1∶2 800。该方法的线性检测范围为0.030～0.500 ng/ml,检测限为0.030 ng/ml。该方法检测大肠杆菌上清蛋白、牛血清白蛋白、LB培养基及破伤风-乙脑结合疫苗均无特异性反应;检测0.500、0.250、0.150 ng/ml的PRP标准品试验内变异系数(CV)在1.16%～2.40%之间,回收率在93.2%～107.2%之间;试验间CV在1.57%～4.11%之间,回收率在101.3%～101.6%之间。结论该方法特异性、准确性和精密性均较好,可以特异性检测b型流感嗜血杆菌多糖。     

检测重组人血小板生成素含量的改良双抗体夹心ELISA方法的建立

目的建立检测重组人血小板生成素(rhTPO)含量的改良双抗体夹心ELISA方法。方法用棋盘滴定法确定包被单抗、一抗和酶标二抗的最佳工作浓度;绘制标准曲线,确定线性范围、检测限和定量限;检测该方法的准确性(回收率)、精密性和特异性,并与Lowry法检测结果进行比较。结果包被单抗的最佳包被浓度为1.0μg/ml,一抗和酶标二抗的最佳使用浓度分别为1∶5000和1∶10000;检测的线性范围为(125～4000)pg/ml,检测限为75pg/ml,定量限为189pg/ml;不同浓度rhTPO的回收率在(97.0±2.1)%～(105.0±8.5)%之间;6批样品的试验内变异系数在3.2%～8.1%之间,试验间变异系数在5.7%～10.4%之间,特异性良好;与Lowry法检测结果具有良好的相关性。结论已建立检测rhTPO含量的改良双抗体夹心ELISA法,准确性、精密性、特异性良好,可用于rhTPO研究及生产过程中的定量分析。     

D2蛋白酶间接ELISA检测方法的建立

目的建立D2蛋白酶间接ELISA检测方法,为D2蛋白酶的进一步研究及应用奠定基础。方法以纯化的D2蛋白酶为抗原,免疫新西兰白兔,制备D2蛋白酶多克隆抗体,建立D2蛋白酶间接ELISA检测方法,并进行验证及初步应用。结果D2蛋白酶间接ELISA检测方法的最佳反应条件为:一抗稀释度为1∶64000,二抗稀释度为1∶80000,抗原稀释度为1∶100,饱和包被浓度为1160ng/ml,封闭剂为10%胎牛血清。标准曲线的线性检测范围为18～1160ng/ml。该方法准确性、重复性良好,特异性强、敏感性高,与琼脂扩散试验检测结果的符合率为95.5%。结论已建立了D2蛋白酶间接ELISA检测方法,可用于D2蛋白酶含量的检测。