产朊假丝酵母分批发酵生产谷胱甘肽的代谢通量分析

根据产朊假丝酵母利用葡萄糖作为惟一碳源生物合成谷胱甘肽的代谢网络,利用代谢通量分析方法分析了谷胱甘肽分批发酵不同阶段各代谢途径碳通量的分布和变化规律.在此基础上,通过分阶段温度控制和L-半胱氨酸添加等策略,调节谷胱甘肽分批发酵过程中的代谢通量分布,谷胱甘肽生物合成的产量明显提高,最大增加幅度分别达到23%和91%.同时对这些策略下谷胱甘肽的过量合成机理进行了解释.     

一种H_2S供体纳米乳的制备

目的:制备大蒜素与谷胱甘肽的磷脂复合物的纳米乳。探究纳米乳的H_2S的生成能力。方法:本课题先制备谷胱甘肽的磷脂固体复合物,防止谷胱甘肽在溶剂中溶解,继而制备谷胱甘肽纳米乳和大蒜素纳米乳。谷胱甘肽纳米乳与大蒜素纳米乳混合,释放H_2S。结果:谷胱甘肽磷脂复合物的油水分配系数为0.495,谷胱甘肽磷脂复合物的纳米乳的粒径表征结果是244.5nm,大蒜素的纳米乳的粒径表征结果是209.9nm,含有0.4095 mg谷胱甘肽磷脂复合物纳米乳390μL与含有1.806 mg的大蒜素的纳米乳1720μL反应,有效生成了H_2S。结论:成功制备了大蒜素的纳米乳和谷胱甘肽磷脂复合物的纳米乳,将大蒜素的纳米乳和谷胱甘肽磷脂复合物的纳米乳结合,可释放H_2S。     

谷胱甘肽的提取方法

谷胱甘肽具有重要的生理功能和医用保健价值,文章介绍了谷胱甘肽的常用生产方法;着重对从发酵液中提取GSH的5种方法进行了阐述与比较。对六种常用的谷胱甘肽检测方法进行了介绍。     

谷胱甘肽的生物合成

简要介绍了谷胱甘肽的功能及应用。主要综述了谷胱甘肽的生物合成方法,包括发酵法和酶法。以及相关的菌种选育等工作。     

谷胱甘肽荧光探针的研究进展

谷胱甘肽在生物体的许多生理过程中发挥着重要作用,所以细胞内谷胱甘肽含量的检测对细胞功能研究和病理分析都具有重要的意义。以荧光探针为基础的荧光分析法因其操作简便、灵敏度高和专一性强等优点而备受大家关注,并且有机小分子荧光探针还可以应用于活体细胞和生物体的成像技术。本文主要综述了近年来谷胱甘肽荧光探针的研究现状,并按照谷胱甘肽与探针识别基团的识别机理分类阐述,同时对谷胱甘肽荧光探针的未来发展趋势进行了展望。     

化妆品天然成分原料介绍（XI）

<正>1谷胱甘肽谷胱甘肽(Glutathione)是所有生命细胞中都含有的三肽化合物,是谷氨酸、胱氨酸和甘氨酸的组合。谷胱甘肽是生物新陈代谢的重要中间物质,主要防卫DNA的损伤,尤以小麦胚和酵母中含量最高。谷胱甘肽有还原型和氧化型两种形式,氧化型是其还原型的二硫醚键的链接。谷胱甘肽可     

多肽配基亲和吸附介质的配基密度控制规律

以谷胱甘肽为配基,琼脂糖微球为骨架,探索将谷胱甘肽通过共价键偶联到琼脂糖微球骨架上,制备可以分离谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S-transferase, GST)及以其为标签的融合蛋白的亲和吸附介质.采用正交实验方法考察了谷胱甘肽加入量、偶联缓冲液的pH值和反应温度对亲和介质配基密度的影响.结果发现,该反应过程中的pH值对配基密度影响最大,其次为谷胱甘肽的加入量.用所制备的亲和吸附介质纯化GST(大鼠肝脏谷胱甘肽S转移酶),发现GST的吸附量随配基密度增加而增加,但GST活性却随配基密度的增加而下降,较好的干胶配基密度为260 μmol/g.大鼠肝匀浆液经过离子交换和亲和层析两个步骤,获得了电泳纯的GST,比活力为12.08 U/mg,总活性回收率为40%以上.     

谷胱甘肽和壳聚糖美白活性的研究

通过测定壳聚糖、壳低聚糖、谷胱甘肽对酪氨酸酶活性的抑制率，对它们的美白功效进行了测定，并与熊果苷进行了比较。结果表明，壳聚糖、壳低聚糖、谷胱甘肽对酪氨酸酶活性有明显的抑制作用，其中谷胱甘肽的抑制作用最为明显，在较低的浓度下就具有很高的抑制效果；把壳聚糖和谷胱甘肽与熊果苷复配，可使抑制率达到90％以上。     

皮肤中初级抗氧化剂及其在化妆品中的应用研究进展

介绍了皮肤的初级抗氧化系统,综述了各种抗氧化物质,包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、醛酮还原酶等酶类物质和维生素A、维生素C、维生素E、类胡萝卜素、辅酶Q10、谷胱甘肽、硫氧还蛋白、金属硫蛋白、铜蓝蛋白、硒等非酶类物质的抗氧化作用,以及抗氧化化妆品的发展现状,并展望了化妆品抗氧化剂的发展前景。     

利用啤酒废酵母间歇发酵合成谷胱甘肽的研究

研究利用啤酒废酵母生产谷胱甘肽的目的是降低谷胱甘肽生产成本、提高啤酒废酵母附加值。研究考察了在2升通气搅拌罐中通气量、搅拌速度、初始葡萄糖浓度以及废酵母加入量对谷胱甘肽合成的影响。实验表明,好氧活化可以显著提高酵母细胞内的谷胱甘肽含量。由于啤酒废酵母的添加量较大,使得反应液中菌体浓度较高,发酵过程中保持较大的通气量和搅拌速率有利于提高细胞活性和促进谷胱甘肽的积累。通过实验确定了2L发酵罐中较佳的操作参数为搅拌速度500rmin-1,通气量6 LL-1min-1。过高的初始葡萄糖浓度对谷胱甘肽的合成有一定的抑制作用,比较合适的初始葡萄糖用量为加入的废酵母湿重的10%。废酵母加入量增大会导致胞内谷胱甘肽含量下降,但由于细胞干重的大幅度增加,在实验范围内,最终单位反应器体积的谷胱甘肽产量则随废酵母加入量增大而增大。实验表明,废酵母加入量在湿酵母为100~300gL-1之间是合适的。     

用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌的培养和诱导表达

研究了用于谷胱甘肽合成的温度诱导型重组大肠杆菌的补料分批发酵,通过葡萄糖的脉冲补入,结合溶氧反馈控制技术,实时控制发酵过程中乙酸的产生. 在此基础上,进一步考察了在谷胱甘肽合成酶系诱导表达阶段,流加酵母粉和蛋白胨时重组大肠杆菌的补料分批发酵过程. 结果发现,脉冲补料-溶氧反馈控制技术在流加酵母粉和蛋白胨的补料分批发酵中仍能得到很好的应用,乙酸浓度可被有效地控制在2.5 g/L以下. 通过比较诱导表达阶段流加不同组成的补料液成分,发现添加适量酵母粉和蛋白胨可促进谷胱甘肽合成酶系的表达,在42℃诱导4 h收获的重组大肠杆菌酶法合成谷胱甘肽达到2.46 g/L.     

高产谷胱甘肽酵母菌株的选育和培养条件的初探

以Saccharomyces cerevisiaeG796-2为出发菌株,通过紫外线照射结合乙硫氨酸平板筛选,连续两代诱变筛选分离得到高产突变株Saccharomyces cerevisiae SE-2;摇瓶试验胞内谷胱甘肽含量达到2.2%,较出发菌株G796-2提高62.9%,传代试验表明其遗传性能稳定。对SE-2的培养条件进行了研究。采用正交化实验和双碳源实验对培养基进行优化,结果表明,最佳初糖浓度6%,葡萄糖/糖蜜=3.5:1,半胱氨酸的添加浓度5mmoL?L?1较为适宜。在优化的培养条件下培养39h,SE-2谷胱甘肽总量达180mg?L?1以上,较G796-2提高81.2%。     

谷胱甘肽在水-乙醇混合溶剂中的溶解度测定及关联

采用称质量法测定了283.15～313.05 K下谷胱甘肽在不同配比的水-乙醇混合溶剂中的溶解度。实验结果表明,谷胱甘肽的溶解度随乙醇摩尔分数的增加而下降,随温度的升高而逐渐增大。分别用Apelblat简化方程和λh方程对溶解度数据进行关联,结果表明两种模型方程的回归效果均令人满意。利用van’t Hoff方程估算得到谷胱甘肽在水-乙醇中的溶解焓和溶解熵。两者均随乙醇摩尔分数的增加而增大。谷胱甘肽溶解度的测定及关联为其工业结晶过程设计和工艺优化提供理论依据,对工业生产具有重要的指导作用。     

Isotopically Labeled Clickable Glutathione to Quantify Protein S-Glutathionylation

Protein S-glutathionylation is one of the important cysteine oxidation events that regulate various redox-mediated biological processes. Despite several existing methods, there are few proteomic approaches to identify and quantify specific cysteine residues susceptible to S-glutathionylation. We previously developed a clickable glutathione approach that labels intracellular glutathione with azido-Ala by using a mutant form of glutathione synthetase. In this study, we developed a quantification strategy with clickable glutathione by using isotopically labeled heavy and light derivatives of azido-Ala, which provides the relative quantification of glutathionylated peptides in mass spectrometry-based proteomic analysis. We applied isotopically labeled clickable glutathione to HL-1 cardiomyocytes, quantifying relative levels of 1398 glutathionylated peptides upon addition of hydrogen peroxide. Importantly, we highlight elevated levels of glutathionylation on sarcomere-associated muscle proteins while validating glutathionylation of two structural proteins, α-actinin and desmin. Our report provides a chemical proteomic strategy to quantify specific glutathionylated cysteines.     

HPLC法检测酶法合成中还原型/氧化型谷胱甘肽

建立酶法反应中还原型/氧化型谷胱甘肽含量的液相分析方法。采用ZOABAX SB-C18进行分离,流动相为磷酸二氢钾辛烷磺酸钠溶液∶乙腈(920∶80,V/V),流速1.0 mL/min,检测波长210 nm,进样量20μL;采用外标法定量。还原型/氧化型谷胱甘肽在10~200μg/mL范围内线性关系良好,相关系数分别为0.9994(n=4)、0.9999(n=4),在S/N=3时最低检测限分别为0.037μg/mL、0.019μg/mL;在S/N=10时最低定量限分别为1.90μg/mL、1.12μg/mL;样品加标回收率分别为98.7%~100.6%、98.5%~101.4%;色谱系统稳定性RSD,GSH、GSSH分别为0.44%、1.16%。样品分析显示出本方法操作简便,快速,准确,灵敏度高,稳定性好,适合酶催化反应中还原型/氧化型谷胱甘肽的测定。     

Glutathione production by glutathione‐degrading enzymes displayed on proteoliposomes reconstituted from bovine kidney brush border membranes

Glutathione (L ‐γ‐glutamyl‐L ‐cysteinylglycine) is physiologically synthesized through two ATP‐dependent reactions catalyzed by γ‐glutamylcysteine synthase and glutathione synthase. The present study was designed to produce glutathione without the aid of ATP by using glutathione‐degrading enzymes, γ‐glutamyl transpeptidase and aminopeptidase M, in reverse: intrinsically the former enzyme catalyzes the cleavage of glutathione to give L ‐cysteinylglycine and a γ‐glutamyl moiety and the latter hydrolyzes the peptide linkage of L ‐cysteinylglycine. Both enzymes were simultaneously displayed on proteoliposomes, which were reconstituted from bovine kidney brush border membranes by a cholate dialysis method. The kinetic analysis using artificial substrates, L ‐γ‐glutamyl‐p‐nitroanilide for γ‐glutamyl transpeptidase and L ‐leucine‐p‐nitroanilide for aminopeptidase M, revealed that the proteoliposome reconstitution significantly increased the enzyme activities: for both the enzymes the maximum reaction rates were increased and Michaelis constants with the respective substrates were decreased. When the proteoliposomes were incubated with the amino acids glycine, L ‐cysteine, and L ‐glutamate (or L ‐glutamine) at 37 °C, a new product was determined on HPLC analyses using ODS and cation‐exchange columns, coinciding in retention time with authentic glutathione. This product was identified to be glutathione by LC–MS and ¹H‐NMR, after being purified by gel filtration using Sephadex G10 and HSKgel Toyopearl HW‐40F in succession. When the incubation mixture contained acivicin and bestatin, specific inhibitors for γ‐glutamyl transpeptidase and aminopeptidase M, respectively, glutathione was not produced at all. These results indicated that glutathione was produced by two‐step reversible reactions of aminopeptidase M and γ‐glutamyl transpeptidase from its constituent amino acids. The equilibrium glutathione concentration obtained with L ‐glutamine as a glutamyl donor substrate was about 3.5 times higher than that obtained with L ‐glutamate. The maximum pH for the glutathione production was 7.0–7.5, reflecting pH dependence of the activities of the enzymes. Copyright © 2004 Society of Chemical Industry     

基于氮掺杂碳纳米颗粒荧光猝灭-恢复方法检测还原型谷胱甘肽

分别以海藻酸钠和色氨酸为碳源和氮源,采用固相法一步合成出了量子产率为47.9%的氮掺杂荧光碳纳米颗粒(N-CNPs)。根据铜离子存在的条件下,N-CNPs荧光强度的恢复情况与还原型谷胱甘肽浓度成正比的关系,建立基于N-CNPs检测还原型谷胱甘肽的新方法。优化了溶液pH及反应时间等条件。在pH 6.0、铜离子浓度30μmol/L条件下,谷胱甘肽在0.2~45μmol/L浓度范围内与N-CNPs荧光恢复强度呈良好的线性关系,检出限为50 nmol/L。方法具有灵敏度高、选择性好、操作简单等优点,可用于实际样品中谷胱甘肽的检测。     

应用蛋白质工程法制备含硒单链抗体酶

目的 制备一种具有谷胱甘肽过氧化物酬（ＧＰＸ）活性的含硒单链抗体酶。方法 利用ＲＴ－ＰＣＲ方 法从杂交瘤细胞株２Ｆ３中扩增出单克隆抗体重链可变区和轻链可变区基因。经ＤＮＡ序列测定后,构建成表达载体 ｐＴＭＦ－ｓｃＦｖ,经过金属螯合层析纯化、复性和化学诱变,得到含硒单链抗体酶。结果 将重组质粒ｐＴＭＦ－ｓｃＦｖ分别转 化入大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）和 ＢＬ２１（ｃｏｄｅｎ　ｐｌｕｓ）,表达目的蛋白分别占菌体总蛋白的５％－１０％、１５％－ ２０％和 ２５％－３０％。该重组蛋白以包涵体形式存在,相对分子质量为３００００。其 ＧＰＸ活性为３４００Ｕ／μｍｏｌ,接近天 然酌水平。结论 为工业化制备含硒单链抗体酶奠定基础。